簡介
目的探討匹那地爾對高鉀停搏液處理後大鼠離體心肌細胞內游離鈣與舒縮功能的影響。方法SD大鼠心室肌細胞酶解分離靜息1～2h後隨機分為對照組，高鉀停搏液組，匹那地爾強化組，格列苯脲拮抗組。四組細胞均在24℃下保存2h,此後對細胞進行復氧、復灌20min並測定細胞收縮、［Ca2+］i瞬態、肌漿網內貯鈣釋放功能。結果匹那地爾使心肌細胞在缺血再灌注中收縮功能，［Ca2+］i瞬態，肌漿網內貯鈣釋放能力明顯優於高鉀停搏液組（P＜0.01〉及細胞內鈣釋放後的鈣峰迴落時間明顯短於高鉀停搏液組（P＜0.01〉。結論匹那地爾通過維持良好的肌漿網和細胞膜Na+/Ca2+交換體功能來調節鈣瞬態變化，減少細胞內鈣超載從而改善心肌細胞缺血後收縮功能，同時避免了高鉀停搏液的負面效應。
關鍵字
心臟停搏液；心肌細胞；大鼠
雖然高鉀停搏液能起到較好的心肌保護作用，但仍有證據表明暴露在這種溶液後的心肌功能有一定程度的損害，如心肌收縮力下降，細胞內鈣超載［1］，可能與肌漿網鈣釋放及Na+/Ca2+交換體的鈣外排減少有關［2］。激活ATP敏感鉀通道（KATP）可減少L-型鈣通道的鈣內流，促進Na+/Ca2+交換體的鈣外排，使細胞免於損傷和頓抑［3，4］。本研究目的在於用單細胞收縮、細胞內鈣［Ca2+］i瞬態、內質網鈣釋放等功能檢測來探討KATP非特異性開放劑（匹那地爾）對高鉀停搏液處理後大鼠離體心肌細胞內游離鈣與舒縮功能的影響。
材料與方法
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藥物與試劑匹那地爾（Pinacidil批號60K1387），格列苯脲(Glibenclamide批號58H0570)，Fura-2/Am(批號108964-32-5),均購自美國Sigma公司。
無鈣Tyrode氏液配製（mmol/L）：NaCl100、KCl10、KH2PO41.2、MgSO4·7H2O5、葡萄糖20、牛磺酸20，3-(N-嗎啉代)丙磺酸10。沖100%O2用KOH(5mol/L)調至pH7.20。K-H液（mmol/L）：NaCl118.5、NaHCO325、KCl4.75、MgSO41.2,KH2PO41.2、CaCl22.5、葡萄糖11.1。
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左心室單細胞製備成年SD大鼠20隻，由浙江大學醫學院動物實驗室提供。雌雄不拘，體重232g～252g，斷頭處死後，迅速開胸取出心臟，置於4℃氧飽和Tyrode氏液中洗淨血液後固定於Langendorff灌流裝置上用95％O2＋5％CO2飽和的K-H液恆溫（37℃）恆流行主動脈逆行灌注，流速10ml/min。酶解法分離心室肌細胞［5］。先以無鈣Tyrode氏液灌流5min，再以含I型膠原酶0.3g/L的低鈣（50μmol/L）Tyrode氏液灌流5min。取下心臟，去掉心房和基底部組織，將左心室肌剪碎，用吸管緩慢吹打，於含1%牛血清白蛋白的低鈣Tyrode氏液中37℃孵育15min,再將細胞懸液用直徑200mm單層尼龍網過濾，濾液在無鈣Tyrode氏液中分三步復鈣至Ca2+濃度為1.25×10-6mol/L［第一次復鈣：20ml細胞混懸液+20ml無鈣液+70μl（72mmol/L）鈣母液,10min～15min後吸取上端20ml懸液,第二次復鈣:20ml細胞混懸液+20ml無鈣液+14μl（720mmol/L）鈣母液,10min～15min後吸取上端20ml懸液,第三次復鈣:20ml細胞混懸液+20ml無鈣液+28μl（720mmol/L）鈣母液，10min～15min後吸取上端20ml懸液，其餘部分過濾，10min～15min後吸取上端20ml懸液］。心肌細胞在室溫下靜置1h～2h後且鏡檢成活率大於80%。
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隨機分組方法對照組（Con組，）：置於無氧乳酸林格氏液;高鉀停搏液組(CP組)：置於含20mmol/LKCl的無氧乳酸林格氏液;匹那地爾組(CP+P組)：置於含20mmol/LKCl和50mmol/L匹那地爾的無氧乳酸林格氏液;格列苯脲拮抗組(CP+P+G組)：置於含20mmol/LKCl、50mmol/L匹那地爾及10mmol/L格列苯脲的無氧乳酸林格氏液。以上各組細胞均在24℃下保存2h，然後用95％O2＋5％CO2飽和的K-H液復灌，鏡下選擇橫紋清晰，胞膜光整的桿狀活細胞來進行實驗。匹那地爾和格列苯脲的用量見文獻［6］。
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檢測指標
4.1單細胞舒縮測定100μl細胞懸液滴於自製灌流槽中並用95％O2＋5％CO2飽和的K-H液持續灌流（2ml/min）。以0.2Hz頻率，50V強度的電場刺激心肌細胞，視頻跟蹤計算機系統(MedEase-1，南京美易科技有限公司)檢測舒縮參數［收縮幅度(dL)，最大收縮速度(+dL/dtmax)，最大舒張速度(-dL/dtmax)和舒張末期長度］。存儲動態圖像用MedEase軟體分析［5］。心肌細胞在復氧、復灌3min時的各舒縮參數為基礎值，之後連續灌注20min,每隔5min測定一次舒縮參數。
4.2細胞內鈣瞬態測定用細胞內雙波長鈣螢光系統（T.I.L.L，PhotonicsGmbH,Grfelfing德國）檢測細胞內游離鈣濃度，Fura-2/AM為鈣指示劑。先用10-6mol/LFura-2/AM在室溫下負載30min，在頻率為0.2Hz，強度為50V的電場刺激下產生的細胞內鈣離子濃度峰值為鈣瞬態。光信號通過T.I.L.L放大器經Digidata1200輸入計算機，pClamp7.0軟體分析。螢光激發波長分別為340nm和380nm，發射波長510nm，其螢光比值可反映細胞內鈣離子濃度［5］。心肌細胞在復氧、復灌3min時的鈣瞬態為基礎值，之後連續灌注20min,每隔5min測定一次鈣瞬態。
4.3肌漿網內貯鈣釋放功能測定［7］復灌的心肌細胞在電刺激下穩定5min，停止刺激15s加入咖啡因（10mmol/L）［8］。咖啡因誘導的鈣峰與電刺激誘導的鈣峰的比值來表示肌漿網內貯鈣釋放的
