操作方法:
1.秤取1.5g尼龍毛裝入20-30ml玻璃容器或注射器內,填料的體積控制在15毫升左右。因為尼龍毛的鬆緊關係到T細胞的回收率,所以要特別注意。注射器下端配接5厘米左右長的帶有彈簧夾的橡皮管。
2. 加入大量的PBS平衡柱子後,用鋁箔包裹,並置於適當的容器內,高壓滅菌15分鐘。
(商品化尼龍毛柱以上步驟可以省略,經過PBS平衡後可以直接進行下列步驟。)
3. 滅菌的尼龍毛柱垂直固定後放於超淨台內,頂部以鋁箔覆蓋,避免污染。
4. 注射器下端,橡皮管,彈簧夾用無水酒精消毒。打開彈簧夾調節流速在大約3-4ml/min。
5.首先,加入3-4倍柱體的無血培養基平衡,之後加入相同體積的含有血清的培養基平衡(上述培養基都要預熱),最後等培養基液面接近柱填料液面時,關閉彈簧夾。
6. 樣本細胞懸浮液濃度控制在約5×108cells/ml,上樣量一般是1/3-1/5柱體積。樣品加入之後,再加入少量培養液,然後關閉彈簧夾。
7.覆蓋鋁箔,垂直固定,置於消毒過的容器中,於培養箱內37℃孵育1小時。此過程中柱子必須要保持垂直狀態。
8. 從培養箱中拿出柱子,置於超淨台內,除去鋁箔。接上按照4.中的方法消毒的彈簧夾和橡皮管,加入適當體積經37℃預熱的培養基,打開彈簧夾控制流速在3-4 mL/min,流出約5ml之後,流出的培養液基變得不透明,此時其中含有T細胞,收集這一部分培養基。
9. 基本上何時結束收集取決於流出液體中細胞的濃度,實際上,收集的量達到一個柱體積時就可以停止收集,因為即使收集更多的量,回收率幾乎不會增加。
10.上述操作後,細胞的
回收率為: 15~20 %
T細胞含量: 85~95 %
B細胞污染率: 1 5 %
多數細胞被確定為T細胞。
(注)收集粘附於尼龍毛上的細胞時,將T細胞收集完畢後的尼龍毛再無菌操作的狀態下取出,轉移到適當的容器中,用鑷子小心的將尼龍毛鬆開,粘附的細胞可以洗到培養基中。或者將注射器芯插入注射器內,通過壓力使的粘附的細胞隨著液體流出。
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