小立碗蘚概述
小立碗蘚（Physcomitrella patens）在分類上屬於葫蘆蘚科，小立碗蘚屬，分布於歐洲、亞洲、非洲及大洋洲，我國湖南省張家界地區有分布。小立碗蘚是一種非常理想的植物分子生物學研究材料。它生長所需營養簡單，容易培養；其配子體在生活史中占優勢，對其突變體的表型可以進行直接研究；其核基因組易於與有同源片段的外源DNA發生高頻率的同源重組，從而使得精確的基因破壞和基因敲除成為可能，為基因功能的研究提供了良好的材料。小立碗蘚與高等陸生植物有很多相似特點，而小立碗蘚的一些特性使得它比其他植物更易於進行分子生物學的研究。小立碗蘚在國外已經成為植物分子生物學研究的模式生物。
小立碗蘚的特徵特性
小立碗蘚植物體矮小，黃綠色，有光澤，稀疏叢集。其莖細而短。葉片呈卵形或披針形，莖基部的葉較小，中肋單一、細長。蒴柄短粗，孢蒴呈圓球形或梨形，對稱、不伸出葉叢，無蒴蓋分化，孢蒴成熟後不規則開裂，蒴齒缺如，蒴帽極小，呈鐘形。成熟後基部四瓣淺裂。孢子呈球狀腎型。
小立碗蘚的原絲體小立碗蘚的生活史
在小立碗蘚的生活史中，配子體世代占優勢，孢子體細胞經減數分裂形成孢子，孢子萌發形成原絲體。原絲體是由頂端細胞經一系列分裂形成的綠絲體細胞組
小立碗蘚的莖葉體成的，綠絲體細胞含有大量葉綠體，頂端細胞的分裂周期大約為24 h。綠絲體的次頂端細胞經過有限次數的分裂形成側枝。頂端細胞經過轉變，繼續分裂形成軸絲體。軸絲體是另外一種原絲體，其細胞內容物較少，葉綠體數量較少。像綠絲體一樣，軸絲體的延伸也需要頂端細胞的不斷分裂，但其頂端細胞的分裂周期只有6 h。而且，其線性延伸的速度也很快，可達40 mm/h，而綠絲體只有2 mm/h。這使得它可以在土壤或瓊脂中快速生長。軸絲體的次頂端細胞進行有限次數的分裂形成側枝。很多側枝在強光條件下發育成綠絲體，其他發育成軸絲體和芽。芽的發生是植物生長從二維原絲體生長轉變成三維的植物體生長的轉化過程。芽產生配子和配子囊，小立碗蘚為雌雄同株，但雌雄生殖器官即頸卵器和精子器分別在不同的枝上。精子器成熟後頂端裂開，精子溢出體外，藉助水游到頸卵器附近，進入頸卵器，與卵接合，形成合子，合子不經休眠，即在頸卵器內發育成胚。胚逐漸分化形成蒴柄和孢蒴。蒴柄深入母體形成基足，基足吸收養料，蒴柄上長有孢蒴，小立碗蘚孢蒴的結構比其他苔蘚植物簡單，沒有幫助孢子釋放的結構。每個孢蒴中大約產生4 000個孢子。小立碗蘚在培養條件下，大約8周完成一次生活史。小立碗蘚幾乎所有的細胞，不管是孢子體的還是配子體的，都可以再生為原生組織。孢子體產生的原生組織可再生為配子體，這說明孢子體與配子體表型上的差異並不是由核型產生的。 原生質體很容易從幼嫩的原生組織中分離獲得，在沒有激素的介質中，原生質體也能長得很快。原生質體可直接形成綠絲體，這個過程類似於孢子發育過程。
小立碗蘚的分子生物學特點
小立碗蘚有27條染色體相對於其他苔蘚植物較多一些。利用流式細胞儀分析得到的小立碗蘚核基因組大約為511 Mb，比一般開花植物的基因組低。Southern雜交表明：小立碗蘚基因組中至少含有一個高度重複序列的基因家族。溫度變性試驗表明：基因組中G+C含量為34.6%。小立碗蘚的基因組與其有同源序列的外源DNA片段易於發生同源重組。在某個小立碗蘚的轉基因品系中，用相同的質粒對其進行再次轉化，結果發現，原來轉入的基因發生沉默，基因分析表明: 第二次質粒的插入位點在第一次獲得該轉基因品系的質粒的插入位點上或在其附近。這表明在第二次轉化過程中轉入的質粒與重組品系的基因組之間發生了同源重組。這就使基因打靶技術在小立碗蘚中成為可能。對高等陸生植物進行轉基因，含有同源序列的質粒與基因組發生同源重組的幾率很小，只有0.01%~0.1%。而在小立碗蘚中，同源重組率就大得多。而同源重組可以讓植物分子生物學家們通過敲除目標基因來研究不同基因的功能。
小立碗蘚的培養
小立碗蘚生長所需營養較簡單，容易培養。可以用水培或用只含無機鹽的培養基培養。通常情況下，用鋪有瓊脂的培養皿或盛有水的錐形瓶培養即可。小立碗
在發酵罐中懸浮培養的小立碗蘚一個得到原生組織的簡單方法是將原生組織勻漿並接種於新鮮瓊脂培養基上。在上面覆蓋一層玻璃紙可以減緩組織的生長速度，簡化最終得到的組織。一周后，培養得到的組織大部分由綠絲體細胞組成，是獲得原生質體良好材料。一個標準培養皿（直徑90 mm）接種一周可得到乾重50 mg的組織（25℃,白光）。用纖維素酶消化可以得到5×10 6個原生質體。小立碗蘚在22-27℃的環境中，生長最迅速，15℃時生長緩慢，但這個溫度可以誘導配子體產生。植物體在連續光照條件下生長良好，16 h光照、8 h黑暗的周期處理可以誘導原絲體組織的分化。
培養小立碗蘚的原生質體可以利用半連續式光合自養生物反應器，使用這種方法不但可以獲得用於轉化的大量原生質體，並且可以利用小立碗蘚的原生質體生產蛋白。利用添加2.5 mmol/L酒石酸銨的knop培養液，通入含2%CO2的空氣，pH值控制在4.5-7.0，可得到最大比生長速率為0.57/d。利用5 L的生物反應器每天可得到1 100 mL的懸浮培養物，稀釋率為22%。在培養基中添加一些微量元素和一些輔酶、維生素等可以提高原生質體培養的最大成活率。
得到的小立碗蘚突變體可以保存在液氮里, 但是其組織在冷凍和解凍過程中可能死亡，如果不進行繼代培養，將組織密封於培養皿中，置於15℃條件下，則至少可保持一年。
