多肽蛋白藥物

多肽和蛋白質類藥物指用於預防、治療和診斷的多肽和蛋白質類物質生物藥物。多肽是α-胺基酸以肽鏈連線在一起而形成的化合物,它也是蛋白質水解的中間產物。N條多肽鏈按一定的空間結構纏繞糾結就構成了蛋白質。大分子蛋白質水解會生成多肽。   生物藥物按藥物的結構分類可分為:胺基酸及其衍生物類藥物、多肽和蛋白質類藥物、酶和輔酶類藥物、核酸及其降解物和衍生物類藥物、糖類藥物、脂類藥物、細胞生長因子和生物製品類藥物。

基本概念
多肽和蛋白質類藥物指用於預防、治療和診斷的多肽和蛋白質類物質生物藥物。多肽是α-胺基酸以肽鏈連線在一起而形成的化合物,它也是蛋白質水解的中間產物。N條多肽鏈按一定的空間結構纏繞糾結就構成了蛋白質。大分子蛋白質水解會生成多肽。 生物藥物按藥物的結構分類可分為:胺基酸及其衍生物類藥物、多肽和蛋白質類藥物、酶和輔酶類藥物、核酸及其降解物和衍生物類藥物、糖類藥物、脂類藥物、細胞生長因子和生物製品類藥物。
多肽和蛋白質類藥物特點
1) 基本原料簡單易得
多肽和蛋白質類藥物主要以20種天然胺基酸為基本結構單元依序連線而得,代謝物胺基酸為人體生長的基本營養成分,可通過農產品發酵而製備。
2)藥效高,副作用低, 不蓄積中毒
多肽和蛋白質類藥物本身是人體內源性物質或針對生物體內調控因子研發而得,通過參與,介入,促進或抑制人體內或細菌病毒中生理生化過程而發揮作用,副作用低,藥效高,針對性強,不會蓄積於體內而引起中毒。
3)用途廣泛,品種繁多,新型藥物層出不窮
多肽和蛋白質類藥物是目前醫藥研發領域中最活躍, 進展最快的部分,是二十一世紀最有前途的產業之一。將20種基本胺基酸按不同序列相互連線, 可得到品種繁多,可用於治療各種類型疾病的多肽和蛋白質類藥物。眾多新型多肽和蛋白質類藥物在治療愛滋病,癌症,肝炎,糖尿病,慢性疼痛效果顯著。
4) 研發過程目標明確,針對性強
藉助生命科學領域取得的大量研究成果, 包括對各類疾病發病機理的揭示, 對體內各種酶, 輔酶, 生長代謝調節因子的深入認識, 可以針對性開展多肽和蛋白質類藥物的研發。
多肽和蛋白質類藥物研發技術與方向
1) 化學合成方法
以化學合成方法研製開發多肽和蛋白質類藥物,已成為廣泛採用的有效手段。通過液相合成,固相合成,固/液合成相結合以及片段連線等方式, 已成功研發眾多多肽和蛋白質類藥物。
2) 改造生物活性多肽及現有多肽藥物
以生物活性多肽或現有多肽藥物作參照,通過組合篩選,胺基酸序列簡化或替代改造,是研發多肽藥物的有效途徑。
3) 提高活性多肽及現有多肽藥物檔次
通過對內源性多肽或現有多肽藥物進行結構修飾,以克服原有產物的弱點,減少副作用,提高藥效, 是研發多肽蛋白質類新藥的重要渠道。
4) 針對具生物活性的多肽天然產物研發
以生物活性天然多肽,尤其是海洋生物活性多肽為模板, 開展構效關係研究,以提高活性與效價,簡化結構並降低副作用,是研發多肽蛋白質類新藥的重要方向。
5) 生物技術製備多肽和蛋白質藥物
採用生物技術製備多肽藥物,是研發新型多肽和蛋白質類藥物的重要方法. 生物技術與化學合成方法相結合, 優勢互補, 將可更好提高研發效益。
多肽和蛋白質類藥物傳輸系統研究進展
隨著生物工程技術的迅速發展,生物技術活性物質不斷面世,已有不少生物技術藥物套用於臨床,國內外已批准上市的約40多種,1995年開發數為234種,目前正在研究的則成倍增加,在這些品種中,大量的均為多肽和蛋白質類藥物。由於多肽和蛋白質藥物的體內外不穩定性,臨床主要劑型是溶液型注射劑和凍乾粉針。為解決長期用藥的問題,克服注射劑的不便和缺點,發展適宜給藥途徑的非注射傳輸系統是藥劑學面對的挑戰。
發展多肽和蛋白質類藥物傳輸系統的關鍵問題
1、蛋白質藥物的結構特徵
蛋白質分子的化學結構決定其活性,影響活性的結構因素主要為胺基酸及其排序、末端基團,肽鏈和二硫鍵位置等 醫學教 育網收集整理 。除外,藥物的空間結構即二維、三維結構也同樣影響生物活性。另外,多肽及蛋白質的分子量常為數千至幾十萬,顆粒大小在l~100nm之間,不能透過半透膜。
2、蛋白質藥物體內外不穩定性
蛋白質藥物在體內外環境可能經受多種複雜的化學降解和物理變化而失活,如凝聚、沉澱、消鏇化、水解、脫醯氨基等。 提高穩定性的方法包括(1)溫和的生產條件如對溫度、機械攪拌強度和有機溶劑的選擇,對無菌條件的控制,容器的吸附效應,水分控制,低溫冷藏等。(2)設計正確的處方如PH、緩衝對、電解質;加入適宜穩定劑、凍乾保護劑、阻聚劑如非離子表面活性劑、糖、甘露醇、山梨醇、PEG、人血清白蛋白等以及製備包合物等。
3、蛋白質藥物的吸收特徵
蛋白質藥物半衰期短、清除率高、分子量大透股能力差、易受體內酶和細菌以及體液的破壞、非注射給藥生物利用度低,一般都僅為百分之幾,如狗口服亮丙瑞林醋酸酯的生物利用度低於3%。提高蛋白質藥物吸收的方法一般有化學修飾或製備成前體藥物,使用酶抑制劑,吸收促進劑,選擇適宜劑型保護等。
多肽和蛋白質類藥物注射給藥系統
1、前體藥物注射液
為延長藥物半衰期,控制進入血液速度,常採用PEG對蛋白質結構進行修飾,如用PEG連結的蛋白質使之變大而不易被腎小球濾過,延長了半衰期,如腺苷酸脫氨酶(ADA)與PEG連結用於治療免疫缺損綜合徵已為FDA批准。
2、注射用微球
發展注射用微球的主要目的是為了達到緩釋效果。1986年法國Ipsen生物技術公司上市肌注曲普瑞林一聚丙交酯乙交酯微球,此後又陸續生產了醋酸亮丙瑞林、布會瑞林和 meterelin肌注微球,臨床上用於治療一些激素依賴性疾病,如前列腺癌、子宮肌瘤、乳腺癌、子宮內膜異位等。人體每月注射1次亮丙瑞林(75mg)微球治療前列腺癌時相當於每天注射1mg溶液劑。改變共聚物比例或分子量可得到不同持續時間的作用。 正在研究的其它微球製劑有皮下注射的生長激素釋放因子(GRF)毫微球,大鼠皮下注射後可緩釋24小時,比溶液劑生物利用度提高20倍。
3、靜脈注射用脂質體
有報導將各種細胞因子如 GM-CSF、IFN-r、 IL-1、IL-2、IL-6等包埋於脂質體中,可經r-射線照射滅菌,低溫貯存3個月以上,靜脈注射達緩釋效果,並改變如IL-2等在體內的分布和蓄積特性,更易進入細胞發揮作用,提高受體敏感性。類似的用脂質體包理TNF-a也明顯提高其細胞毒活性,對非敏感的抗性細胞也有活性,表明脂質體對靶細胞有敏化作用免疫脂質體的製備方法也同樣套用於生物技術藥物。
4、疫苗控釋製劑
一次接種疫苗以達到完全免疫、提高接種類、減低接種費用是世界衛生組織疫苗發展規劃的主要目標之一。目前進行的研究的疫苗控釋製劑主要是微球或其它微粒製劑,通過材料的選擇和包理程度,可控制疫苗釋放速度,如速釋及恆釋,脈衝釋放等。研究的疫苗包括類毒素疫苗如白喉、破傷風、氣性壞疽、霍亂等,病毒疫苗如B肝疫苗等、核酸疫苗及人工合成疫苗等。
多肽和蛋白質類藥物鼻腔給藥系統
鼻腔黏膜面積約 200 cm2,上皮細胞間隙較大並與毛細血管緊密相連,血管和淋巴管豐富,血流速度約40 mL/min等均是藥物經鼻腔吸收的有利條件。脂溶性藥物進入鼻腔後較易吸收並直接進入全身血液循環,免受肝臟及胃腸道的首過破壞。合理的鼻腔給藥劑型應具有如下特點:在鼻黏膜的濃度高,與鼻腔黏膜接觸面積大,容易吸收,不影響鼻腔屏障功能、嗅覺功能和潤濕吸人空氣、調節吸入空氣溫度等功能。 研究的劑型包括溶液和粉末或微球。一般均採用噴霧給藥以深入鼻腔。粉末或微球的滯留時間長,吸收好,藥物含量高,給藥體積小,有利於藥物穩定,但可能產生鼻黏膜刺激。採用吸收促進劑和酶抑制劑等可提高多肽及蛋白質藥物鼻腔吸收,延長滯留時間。藥物將胰島素澱粉微球給綿羊滴鼻,其相對生物利用度提高至10 7%,將微球與膽鹼溶血磷脂聯合使用,則進一步提高至31.5%,而溶液劑滴鼻則僅為1%。一種鼻腔給藥的流感疫苗FluMist由活疫苗組成,較滅活病毒製品產生的作用強,保護作用持久,已在美國進行3期臨床研究。研究套用的吸收促進劑包括膽鹽、脂肪酸、皂角苷、辛酸鈉、月桂酸鈉和聚丙烯酸等。但長期套用可損害鼻黏膜和纖毛,一些促吸劑具刺激性。梭鏈孢酸衍生物如牛磺酸二氫梭鏈孢酸鹽和環糊精可能是一種較安全有效的促吸劑。
多肽和蛋白質類藥物肺部吸入給藥系統
肺部的表面積高達70m2,遠大於鼻腔等除胃腸道以外的其它途徑的吸收面積,而且肺泡毛細血管豐富,上皮細胞間隙較大,是很有前景的途徑。肺部吸入系統一般首選為小劑量的粉霧劑系統,乾粉吸入避免了溶液劑中藥物的降解,微粉化技術保證了藥物不在氣管或支氣管滯留,順利進入肺部組織。氣霧劑也有套用,但一些多肽或蛋白質在形成氣溶膠微粒時發生變性。 肺吸入給藥的限制是其吸收和有效的重現性問題以及長期給藥可能帶來的臨床副作用。選擇合適的給藥裝置是解決肺部給藥的關鍵。一種帶壓縮部件的裝置可以定量釋放15uL含水的藥物氣霧劑,使其均勻沉積在肺的邊緣、中間和中樞區域,沉積率為39%,是一般吸人器吸入沉積率的4倍。由Innovate Biomed公司研究的乾粉吸入器,沉積率達30%,是一般吸入器的3倍。 微粉化是乾粉吸人劑取得成功的另一關鍵。根據不同給藥沉積部位要求,粉末粒子大小應在幾個微米範圍。粉碎方法有氣流粉碎(噴射磨)、噴霧乾燥、攪拌離心、超臨界粉碎等。 人體實驗中亮丙瑞林氣霧劑的吸收可達18%,製劑中加入l%的甘油或A-zone,在大鼠實驗中吸收率達到100%。胰島素吸入治療是多家製藥公司開發的熱點。吸入治療公司和輝瑞公司合作開發的胰島素的肺部吸人劑已完成2期臨床,結果表明吸人本品與口服二甲雙服或磺豚類藥物合用可改善僅口服後者對2期糖尿病患者的血糖控制,療效與注射相同,目前正在進行3臨床研究。在2um大小的胰島素的乾粉中混入25%癸酸鈉,胰島素在狗的肺中吸收提高2.5倍。
多肽和蛋白質類藥物口服給藥系統
生物藥物的口服給藥是難度最大而又最熱門的給藥途徑。多肽或蛋白質的口服後一般在胃腸道降解成小分子胺基酸後吸收,其生物活性也隨之消失。阻止這些大分子口服吸收進入的主要屏障是緻密的腸上皮細胞膜、胃酸和各種消化酶。因此改進其生物利用度的焦點就是如何減少這些屏障的作用。
1、促滲透劑的套用
常用的方法是使用促滲劑,如表面活性劑、脂肪酸或膽鹽,增加粘液層和上皮細胞層的通透性,擴大細胞間隙。最常用的口服吸收促進劑是膽鹽和脂肪酸,也有人使用水楊酸鈉。該類物質的最大缺點是無選擇性地作用於脂質表面而可能使所有小腸內容物成分包括各種毒素和生物病原體進入血液,也有潛在的細胞膜溶解和局部炎症等毒性。 一種頗有前途的促滲劑是由特殊細菌產生的蛋白毒素,Zonula occludens toxin(ZOT)。ZOT特殊作用於actin filaments of zona occludents而不影響全腸道功能的完整性,而且 ZOT僅對小腸和十二指腸的受體有效而不作用於直腸和結腸。因此其細胞內通道作用安全、可逆、具時間和劑量的依賴性、限定於某些部位。給糖尿病動物服用加有5ugZOT的10IU胰島素,即從原來的無降糖作用而轉為顯著的降糖作用並維持最大有效性 100 min,相當於皮下注射 1.2~2.4IU胰島素,即相對生物利用度為 8%~16%。
2、蛋白酶抑制劑
套用蛋白酶抑制劑可阻止胃腸消化酶對胰島素等的破壞。常用的酶抑制劑有甘膽酸鈉、camostat mesilate、bacitracin、aprotinin、大豆胰酶抑制劑等,前3種效果較佳,主要影響蛋白酶集中的大腸段的吸收。結合套用促吸劑能取得更好的效果。例如同時服用 12IU的胰島素、10mg/mL膽酸鈉和 aprotinin,禁食大鼠的血糖下降達 70%,而只與膽酸鈉或與 aprotinin合用,血糖只下降 30%。
3、劑型和製劑技術
(1)腸溶衣製劑對胰島素膠囊或微九採用腸溶材料丙烯酸樹脂包衣可減少胃酸和部分酶的破壞,達到定位釋放。在 PH7.5~ 8.0釋放藥物,大鼠口服16IU胰島素的降糖效果與腹腔內注射4IU胰島素的效果類似,相對生物利用度為9.3%~12.7%。 (2)微球和毫微球將胰島素製備成小於2um的生物降解或不降解材料的微球,既能減少藥物的破壞,也可能通過空腸絨毛尖端細胞脫落形成的間隙或Payer’s結吸收,也可以緩慢釋放藥物,通過胃腸上皮細胞正常吸收轉運到肝、脾和其它組織,降低血糖以及肝糖原的積累。大小在250~300urn的聚異丁基腈基丙烯酸微球可在30~60min內穿透腸黏膜,其途徑包括細胞間隙途徑和Payer’s結的M細胞。通過大鼠分腸段給藥100IU/Kg胰島素微球,最大吸收在迴腸(65%),蕨為空腸和十二指腸(50%),最低為結腸(30%)。 (3)微乳、復乳和脂質體 將胰島素製備成口服微乳可以改進其吸收。狗十二指腸給予15IU/kg的W/O型胰島素微乳,採用同位素示蹤法測定其上腔靜脈及下腔靜脈的血藥濃度,表明做乳口服吸收的主要途徑為淋巴途徑,上腔靜脈血藥濃度為下腔靜脈血藥濃度的2.55倍。國內曾研究過胰島素口服復乳,給予糖尿病模型小鼠灌胃給藥後具有肯定的降血糖作用。用脂質體作為口服蛋白質和多肽藥物的載體至今仍在研究,包括胰島素、葡萄糖氧化酶、凝血因子Ⅷ、各種細胞因子類藥物等。有報導糖尿病大鼠口服胰島素脂質體後的顯著降糖作用,3小時到達最大值,而對正常大鼠血糖無影響,但學術界對此存在爭議。 利用口腔黏膜吸收胰島素,藥物迅速進入口腔黏膜下頜靜脈而人血液循環,避免了肝臟代謝。據認為,這類黏膜吸收製劑的吸收程度與製劑因素有很大關係。簡單地套用HPC與卡波沫934壓制而成的園形片,吸收很差。有人製備了一種兩面貼上拱形製劑,胰島素分散在帶有拱形貼上層的藥芯中而外圈是分散有甘膽酸鈉等促吸劑的油性材料。
多肽和蛋白質類藥物透皮給藥系統
脂質體作為生物藥物透皮給藥的載體已有大量報導,如胰島素、干擾素、膠原蛋白、肝素、過氧化物歧化酶、組織生長因子等。脂質體的主要材料是磷脂,磷脂分子在一定條件下形成雙分子層,與角質層細胞間隙的類脂雙分子層有相同結構,推測這種結構有利於兩者的親和,從而改進藥物的滲透速率。 透皮傳遞體是一種由類脂材料製備的納米脂質體,除了體積小以外,更重要的特徵是這種載體具有高度變形性。在一定的水合壓力下(來源於皮膚表面液體水分的蒸發和皮膚內各層次水分濃度梯度),其類脂膜可以發生形變,實驗研究報導該載體可將胰島素輸人體內並達到皮下注射水平,具有迅速的降血糖作用,而同樣大小的脂質體卻不能攜藥通過。 離子導入法可增加離子藥物的皮膚通透量,在一定的電場條件下,離子藥物通過電導、電滲和溶劑牽引等機理通過毛孔、汗腺等通道進入皮膚,採用離子導人結合脂質體的方法也可驅使脂質體進入角質層。與離子導人不同,電致孔方法是在高電壓脈衝電流作用下,在皮膚角質層形成短暫親水性微孔以增加藥物透人的方法。
[編輯本段]多肽和蛋白質類藥物分析方法
1.1 生物檢定法
由於蛋白多肽類藥物多為有生物活性的物質,且生物活性不僅取決於藥物的一級結構,與二 、三級結構亦密切相關,故生物檢定法是研究該類藥物動力學獨特而必需的方法。生物檢定 法 有兩個目的,直接測定體液中藥物濃度及鑑定標記藥物的生物活性。其方法主要可分為兩大 類。 1.1.1 在體分析 常規的有胰島素的小鼠血糖法等,另外還有根據各 類蛋白多肽的生物活性 不同而建立的各異的方法,如根據IL-8可將大量中性粒細胞從骨中動員出的性質[1] 而建立 的IL-8動員中性粒細胞家兔體內實驗。這類方法最直觀地反映生物活性,但涉及整體動物 ,費時費力,靈敏度不高,變異較大。 1.1.2 離體組織(細胞)分析 如NGF刺激雞背根神經節增長,縮宮素 的大鼠離體子宮法等。 隨著分子生物學的發展,許多特異性強,靈敏度高的依賴細胞株被建立,細胞培養已是最常 用的方法。根據蛋白多肽與細胞相互作用的機理不同,具體的操作亦有多種。如細胞增殖法 (Proliferation assays),快速靈敏,但特異性稍差; 抑制增殖法(Antiproliferation as s ays),檢測系統簡單,靈敏而專一; 減少細胞損傷法(Cytopathic effect reduction assays ) [2],則是依據具有抗病毒活性的藥物如干擾素,保護細胞不受病毒損傷, 方法直觀 靈敏, 但 可能會受到多肽亞型的干擾。以上的方法都是以細胞數目的增減為量效指標,計數方法有直 接計數法和間接計數法,後者包括MTT法,同位素(3H,14C)摻入法 等。此外,還有根據蛋 白多肽與細胞間接作用進行檢測,如與免疫檢測聯用的抗體誘導法[3],結合酶反 應的酶誘 導分解法[4]等。總的說來,細胞培養法多具有靈敏特異,客觀可靠的優點,但其 不足也顯 而易見。首先,生物檢定法無法定量失去活性的小代謝物,無法示蹤它們的體內動態;其次 ,樣品多存在於人或動物血清中,血清中內源物質的干擾以及可能存在的內源因子的交叉反 應,影響了方法的專屬性;再者,啟動生物過程常需閾量細胞因子從而降低了方法的靈敏度 ;依賴株細胞長期培養易發生變異而影響檢測的特異性。
1.2 免疫學方法
免疫學方法是利用蛋白多肽藥物抗原決定簇部位的單克隆或多克隆抗體特異地識別被檢藥物 ,再以放射計數,比色等方法予以定量,即將特異的抗原抗體反應配以靈敏檢測的方法。常 用的方法有三種。 1.2.1 放射免疫法(Radioimmunoassays RIA) 該法是被測藥物(Ag ),標記藥物(多為125I-Ag)與抗體(Ab)的競爭性結合反應,方法的特異性 取決於抗原抗體的親和力及標記藥 物的純度,與生物檢定法相比,有簡明,易於控制的優點。 1.2.2 免疫放射定量法(Immunoradiometrec assays IRMA) 該法中 被測藥物依然是Ag,它 先與固定相上的Ab形成Ab∶Ag複合物,再與標記抗體125I-Ab結合,形成Ab∶Ag ∶125I-Ab夾心 狀。由於Ag需有兩個Ab來識別,這就大大增加了方法的特異性,是一靈敏而低變異的方法, 只是對標記抗體的純度要求很高。 1.2.3 酶聯免疫法(Enzyme-linked immunosorbent assays ELISA) ELISA的原理與IRMA相 似,只是第二個抗體不是用碘標,而是用可以與底物發生顯色反應的酶如HRP來標記,與上 述兩法相比,ELISA具有使用壽命長,重複性好,無輻射源的優點,並且已有不少實驗證明 ,它與生物檢定法具有一定的量效關係[4]及相關性[5],提示它可部分地 反映藥物的生物活性。 免疫學方法的缺點在於它測定的是蛋白多肽的免疫活性而不是生物活性;不能同時測定代謝 物,且具有抗原決定簇的代謝片段可能增加結果誤差;不同來源的抗體與相同的蛋白多肽反 應可能有較大的差別;還可能受到內源物質的干擾。但免疫法畢竟是一種迅速,靈敏,適於 批處理的方法,已有數十種蛋白多肽被開發成能滿足藥物動力學研究的商品藥盒。目前臨床 藥動學領域,免疫法已逐漸取代生物檢定法。
1.3 同位素標記示蹤法
放射性同位素標記技術是研究蛋白多肽在生物體內處置的一種最常用的方法。所使用的同位 素有125I, 99mTc, 3H,14C, 35S 等,其中125I因比放射性高,半衰期適宜,標記製備簡單 而最為常用。標記方法有兩種,一是內標法,即把含有同位素的胺基酸加入生長細胞或合成 體系,該法對生物活性地影響可能較小,但由於製備複雜而限制了其廣泛套用;二是外標法 ,常用化學方法如氯胺T或Iodogen法將125I連線於大分子上,因相對簡單而被首 選。 同位素法具有簡便直觀,檢測迅速的優點,尤其適用於蛋白多肽藥物的組織分布研究,但其 缺點亦顯而易見。首先,它不能進行人體藥物動力學研究;其次,同位素標記後是否會引起 藥物的生物活性及其在生物體內的代謝行為發生變化,一直存在爭議.前者可通過調整反應 條件和生物檢定法加以改善和驗證,基本上可使生物活性無明顯變化;後者因藥而異則複雜 的多,已有報導認為[6],放射性標記法可干擾表皮生長因子與細胞的相互作用, 從而導致 其體內清除的紊亂;最後,由於蛋白多肽進入體內會被降解代謝,或與其它蛋白質結合,總 的放射性不能代表藥物動力學過程,因此如何鑑別樣品的原藥,降解物及結合物是該法中需 解決的關鍵問題,目前常用的方法有兩種。 1.3.1 SDS-PAGE法 根據藥物Mr的大小選擇不同濃度的凝膠電 泳,通過控制電流等條件使得原 藥與其它產物分開,然後通過切割膠條放射計數或放射自顯影的方法,來檢測電泳放射性圖 譜。該法具有較高的解析度和靈敏度,但電泳過程中,125I-小肽和游離 125I可能擴散至空白凝膠或電解液中,從而使結果可能偏高。 1.3.2 HPLC法 高效反相色譜(RHPLC),高效排阻液相色譜(SEHPLC )[7],高效離子交換液相色 譜(IEHPLC)分別根據保留時間與蛋白多肽的疏水-親水性特徵,Mr大小,極性的 關係 來分離樣品中的物質。它們共同的優點是特異性高,解析度好,可同時測定原藥和降解物, 其中SEHPLC亦可得到結合物的信息,而RHPLC用於蛋白多肽的分離有獨特的優越性。但因受 注入樣品量的限制,靈敏度,重現性都受影響,且設備昂貴,成本較高。
1.4 色譜法
1.4.1 HPLC 在進行普通藥物動力學研究中,HPLC是技術成熟,套用廣 泛的分析手段。在蛋 白多肽藥物的實驗研究或產業化中,HPLC都是主要的分離純化工具。但鑒於蛋白多肽藥物結 構的特殊性,除了一些小分子多肽,如peptichemio[8],加壓素的八肽拮抗劑(oc tapeptid e antagonist of vasopressin)[9]可分別直接或經選擇性柱反應後,單獨 用帶螢光檢測 器的HPLC進行藥動學研究外,HPLC常需進一步改進或與其它更靈敏的檢測技術聯用方能滿足 藥動學的需要。除了上述提及的與同位素的聯用,還有許多與免疫學方法的聯用,如Philli ps[10]採用免疫親和色譜技術分析人三種不同體液中粒細胞集落刺激因子的濃度; Partilla [11]等認為HPLC與RIA聯用可以檢測人體液中的神經肽。此外,令人矚目的還有液 /質線上聯用(LC-MS)。 LC-MS將高分離能力,適用範圍廣泛的色譜分離技術與高靈敏、專屬及通用,在研究蛋 白多肽的結構中具有重要價值的質譜法聯用起來,成為強有力的分離分析方法。多年來限制 LC-MS技術發展的決定因素是接口問題,由傳送帶接口(Moving-belt interface),熱噴 霧 接口(Thermospray),到最近的電噴霧離子化接口(Electrosptay ionization ESI),聯 用技術日趨成熟,尤其適用於生物樣品中低濃度(pg/ml)藥物及代謝物的測定[12] ,而蛋 白多肽類藥物恰有在體內代謝快,濃度低的特點。國外已將用LC-MS於該類藥物,藥物代 謝 物[13,14]的動力學研究,國內尚處於起步階段,除了儀器本身價格昂 貴,技術上亦存在 一些問題,如它對樣品的純度要求很高如何將藥物從生物體液,尤其是血漿中提取純化以 減少干擾;如何選擇合適的內標以減少系統誤差;在將LC-MS用於檢測體育禁用肽(HCG,HGH ,EPO,ACTH等)時發現,糖肽難用於質譜分析,因為在質譜條件下,同樣的胺基酸序列可產生 多種不同質量的多糖鏈,而每條鏈及整個分子都有可以產生質譜信號,這就大大降低了質譜 信號的專屬性。目前,儘管LC-MS在蛋白多肽藥物的體內藥物代謝動力學研究中還存在一 定的難度,但其作為實用性強,前景好的領域已引起人們的廣泛關注。 1.4.2 高效毛細管電泳(HPCE) HPCE是離子或荷電粒子以電場為驅動 力,在毛細管中按其 濃度和分配係數不同進行高效,快速分離的新技術,它以高解析度,高靈敏度,分析時間短 ,樣品量少及操作簡單等諸多優點而成為蛋白多肽生物分子分離分析的重要手段。在臨床 上 ,生物體液中低濃度蛋白多肽的分析面臨的問題有:蛋白多肽與毛細管壁的相互作用所引起 的遷移時間的改變,這可以通過塗層CE加以改善;由於毛細管很細,管內容積很小,進樣量 的不易控制給實驗的重複性帶來影響,而且很可能無法對低濃度的樣品提供足夠的靈敏度。 近年來,國外根據樣品的性質採用不同的預處理,大體上可分為非特異性和高親和性兩種, 將樣品加以濃縮,取得了滿意的效果[15]。HPCE在檢測上的迅速發展與HPLC已有並 駕齊驅之 勢,況且鑒於HPCE在樣品微量分析的優越性,已有人在藥物動力學研究、體內分析中,將微 透析連續採樣與之聯用[16],這在整個藥動學研究中都不失為一有希望的方向。 2 結 語 由以上可知,現代科學技術的發展給蛋白多肽類藥物的研究提供了多樣的分析手段,但鑒於 該類藥物的特殊性,目前尚無一種方法能完全滿足動力學研究的要求。根據人用藥物註冊國 際協調會議(ICH)對生物藥物臨床前安全性評價“在科學基礎上的靈活性和具體情節個別 處理”的總則,人們通常將幾種方法聯合套用,互相補充,才能得到比較可靠的結果。

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