培養基組分增殖的影響
不同類型基本培養基對杜鵑蘭原球莖增殖及生長情況有顯著影響。接種於1/2MS培養基的原球莖增殖速度快,長勢較好,原球莖呈綠色,增殖率達120.00%;接種於MS培養基的原球莖增殖速度及長勢稍次於1/2 MS,原球莖呈淡綠色,少數出現褐化現象,增殖率達95.45%;接種於VW和KC培養基的材料部分呈白色,出現水漬狀或褐化,少數死亡。杜鵑蘭原球莖接種10d後,1/2MS培養基中的原球莖顏色由白色轉為淺綠色,接種20d後,原球莖明顯增大,30d後有少數原球莖開始增殖,顏色呈黃綠色,40d時培養基中的原球莖多數已形成叢生型原球莖,顏色轉為綠色。上述結果可能是由於MS培養基成分種類豐富,無機鹽濃度高;VW和KC培養基只含有大量礦質元素,缺少有機元素和微量元素,無法滿足原球莖正常生長的需要;1/2MS較MS培養基無機鹽濃度低。由此可知,杜鵑蘭原球莖生長增殖需要適量的無機鹽、種類豐富的微量元素和有機元素,故接種於1/2MS培養基中的原球莖增殖率及長勢顯著高於其它處理。
植物生長調節物質對增殖的影響
不同種類及濃度的植物生長調節物質對杜鵑蘭原球莖增殖均有不同程度的促進作用,當6-BA濃度為1.0mg·L-1時,形成的叢生型原球莖較多,增殖率達142.22%,顯著高於其它處理組;6-BA濃度為0.5mg·L-1時,增殖率僅次於6-BA 1.0mg·L-1處理,但部分原球莖開始分化;不添加6-BA時原球莖也有較高增殖率,但不及6-BA 0.5、1.0mg·L-1處理;6-BA濃度升高至1.5mg·L-1以上時,增殖率急劇下降,部分原球莖顏色變黃死亡。NAA、IBA對原球莖增殖的影響效果顯著,NAA濃度為0.2mg·L-1時,形成的原球莖較多,呈綠色,表面長有許多白色毛狀物,增殖率顯著高於其它處理組,為140.29%;隨IBA濃度增加,原球莖增殖率不斷變化,IBA濃度為1.0mg·L-1時,增殖率最高,達170.07%,原球莖的顏色呈綠色且生長健壯未分化,濃度高於1.0mg·L-1時,原球莖的增殖率隨濃度升高而下降。
增殖培養最佳化技術
基本培養基最佳化
基本培養基提供植物組織生長的礦物質、碳水化合物。林木組培增殖培養中, 基本培養基最佳化是最經常最佳化的內容。MS培養基是在被子植物門林木組織培養中最為常用的培養基。其具有較高的無機鹽濃度, 常常在大多數樹種中套用。但是因為樹種不同MS培養基有很多地方需要調整, 筆者在快速繁殖美國紅楓“秋焰” (Acer×freemanii) 、“薩摩賽特” (Acer rubrum‘Somerset’) 中增加硝酸銨、硫酸鹽含量改良MS培養基, 發現改良MS對不定芽的增殖作用最明顯, 增殖倍數顯著高於培養基MS、WPM和1/2MS等。然而在樺樹類增殖培養中, 無機鹽含量較低的WPS或者1/3MS等培養基更有利於不定芽的增殖, 如果增加無機鹽的含量很容易導致紫葉白樺 (Betula populifolia‘Whitespire’×B.‘Crimson Frost’) 、垂枝樺 (Betula pendula Roth) 等樹種的玻璃化。我們在山新楊 (Populus davidiana×bolleana) 組培工廠中利用1/2MS作為基本培養基, 用微莖段扦插的方法提高增殖倍數3~4倍。培養基中Ca2+濃度對於其試管苗的增殖生長也起到重要作用, 其濃度增加可有效抑制玻璃化及莖尖壞死, 因此也常常需要通過增添來最佳化。另外增殖培養的基本培養基最佳化時p H值的影響也應該是最佳化的範圍, 而且往往容易忽略, 大多數樹種培養基中p H值的範圍在5.8~6.2之間均可, 但很多樹種需要最佳化, 例如曹增強等[1]通過試驗發現適當的提高培養基p H值 (6.0~6.5) 會促進藍莓分支組培苗的分支, 這樣可以大幅提高增殖倍數。培養基p H為7.0時, 則會促進藍莓組培苗對Fe、Ca和B的吸收。
不同植物激素種類及配比最佳化
植物激素是在調控植物生長發育過程中具有十分重要且複雜的生理效應。在林木快繁增殖培養中主要套用細胞分裂素和生長素調節最佳化不定芽的增殖培養, 細胞分裂素過去常常用6-BA, KT、ZT等。近年來TDZ和CPPU常常用在增殖培養中, CPPU是一種具有顯著生物活性的細胞分裂素, 活性遠高於一般的嘌呤類細胞分裂素，它還有獨特的優勢在於促進細胞分裂後持續的促進生長能力。TDZ作為一種有效的形態發生調節劑, 其特點是通過單獨或與其他生長調節物質共同對植物細胞起作用, 並具有相當高的活性。植物組培中常用的生長素有IBA、.2, 4-D和NAA等, 增殖培養的最佳化過程中不但需要添加細胞分裂素和生長素絕對含量, 而且要最佳化相對含量, 由於植物激素添加含量極 (上接第80頁) 微, 試驗設計添加常常是失之毫釐謬以千里。隨著生物統計學的發展與套用, 近年來利用二次回歸旋轉設計等能夠較好的篩選植物激素的絕對含量和相對含量。同時應該考慮連續多次增殖培養高濃度細胞分裂素的添加會導致組培苗玻璃化的危害。
最佳增殖時間和培養代數最佳化技術
在增殖過程中, 不定芽的生長是個曲線生長過程, 生長速度從啟動生長—快速生長—緩慢生長的過程, 為了實現增殖培養高效的繁殖速度, 需要培養過程中細緻觀察, 在最恰當的時間進行繼代培養。同時不定芽的來源往往是腋芽或間接的愈傷組織等, 繼代培養代數太短往往繁殖效率低, 繼代培養代數過長往往伴隨玻璃化危害、退化等情況的發生。
其他最佳化技術
其他最佳化技術主要包括: (1) 最佳化接種數量, 控制接種不定芽的密度。在增殖最佳化過程中很多實踐者發現不定芽的密度也是需要最佳化的技術, 這點往往被理論學者忽視, 筆者發現為了充分利用培養基、光照和培養空間, 在培養容器內“品”字形接種不定芽, 根據每次接種樹種的不同和不定芽的大小調整接種數量。 (2) 最佳化培養基的注入量。由於不同的樹種在增殖階段生長速度有差異, 增殖時間內消耗培養基的含量自然就會有差異, 因此為了降低成本需要通過細緻入微的觀察調整最佳化培養基的注入量, 有時候也可以考慮重複使用培養基, 筆者在山新楊增殖培養中曾試驗控制培養基的含量, 取得了較好的效果。
