基因槍介導轉化法

基因槍介導轉化法

基因槍法,又稱生物彈法或微粒槍法、微粒轟擊法,是依賴高速度的金屬顆粒將外源基因引入活體細胞的一種轉化技術。它是繼農桿菌介導轉化法之後又一套用廣泛的遺傳轉化技術。這種方法操作簡單,效率高,適應性強。一次可以向數以千計的細胞導人基因,不受細胞、組織或器官的類型限制,此外其目標命中率高,因此格外受重視。基因槍根據其加速裝置可分為火藥式、電動式和氣動式。

簡介

台式基因槍台式基因槍

人類早就夢想能夠突破物種界限,按照人的意願培育或改良動植物新品種。20世紀70年代,DNA重組技術的出現為人類願望的實現提供了可能。在獲得符合要求的基因之後,面臨的是如何將基因導人所選擇的細胞中,並使之穩定表達,出現所期望的遺傳性狀。其中,基因導人是關鍵的環節之一。隨著動植物基因工程研究的相繼開展,先後出現了化學介導、生物介導和物理介導等類型方法。在物理介導法中,有雷射打孔、電擊孔和基因槍等方法。

基因槍法,又稱生物彈法或微粒槍法、微粒轟擊法,是依賴高速度的金屬顆粒將外源基因引入活體細胞的一種轉化技術。它是繼農桿菌介導轉化法之後又一套用廣泛的遺傳轉化技術。這種方法操作簡單,效率高,適應性強。一次可以向數以千計的細胞導人基因,不受細胞、組織或器官的類型限制,此外其目標命中率高,因此格外受重視。基因槍根據其加速裝置可分為火藥式、電動式和氣動式。

利用火藥爆炸或高壓氣體加速(這一加速設備被稱為基因槍),將包裹了帶目的基因的DNA溶液的高速微彈直接送入完整的植物組織和細胞中,然後通過細腦和組織培養技術,再生出植株,選出其中轉基因陽性植株即為轉基因植株。與農桿菌轉化相比,基因槍法轉化的一個主要優點是不受受體植物範圍的限制。而且其載體質粒的構建也相對簡單,因此也是目前轉基因研究中套用較為廣泛的一種方法。

基本原理

基因槍法是一種全新的基因導入儀技術,它把遺傳物質或其他物質附著於高速微彈直接射入細胞、組織和細胞器,是目前國際上最先進的基因導入技術。氣體基因槍以壓縮氣體(氦或氮)轉換成的氣體衝擊波為動力,使氣體基因槍槍產生一種“冷”的氣體衝擊波進入轟擊室,因此可免遭由“熱”氣體衝擊波引起的細胞損傷。氣體基因槍可在廣泛的細胞型中得到瞬時的、穩定的和高效率的轉化作用。氣體基因槍有一個產生衝擊波的特殊結構,在恰當的氣壓範圍內從3.5MPa-10MPa,具有相應不同的可破裂膜 ,將包覆DNA的粒子穿越,射入在轟擊室底部的靶細胞中(最大靶直徑50mm)。基因槍適用於動植物、細胞培養物、胚胎、細菌及小型動物的轉基因。具有快速、簡便、安全、高效的特點、中科院遺傳所、北京大學、浙江大學等有關單位均採用該設備。基因槍法是一種全新的基因導入儀技術,它把遺傳物質或其他物質附著於高速微彈直接射入細胞、組織和細胞器,是目前國際上最先進的基因導入技術。氣體基因槍以壓縮氣體(氦或氮)轉換成的氣體衝擊波為動力,使氣體基因槍槍產生一種“冷”的氣體衝擊波進入轟擊室,因此可免遭由“熱”氣體衝擊波引起的細胞損傷。氣體基因槍可在廣泛的細胞型中得到瞬時的、穩定的和高效率的轉化作用。氣體基因槍有一個產生衝擊波的特殊結構,在恰當的氣壓範圍內從3.5MPa-10MPa,具有相應不同的可破裂膜 ,將包覆DNA的粒子穿越,射入在轟擊室底部的靶細胞中(最大靶直徑50mm)。基因槍適用於動植物、細胞培養物、胚胎、細菌及小型動物的轉基因。

介紹

基因槍轉化實例基因槍轉化實例

美國Cornell大學最早研製了火藥基因槍。1990年,美國杜邦公司推出了商品基因槍PDS-1000系統。此後,高壓放電、壓縮氣體驅動等各種類型的基因槍相繼出現,並在實際套用中得到不斷改進和發展,使基因槍轉化法成為繼農桿菌介導轉化法之後又一廣泛套用的轉化技術。根據動力系統,可將基因槍分為3種類型。第一類是利用火藥爆炸力作為加速動力;第二類是以高壓氣體作為動力;第三類是以高壓放電作為驅動力。儘管基因槍有各種不同的類型,但基因槍轉化的基本步驟如下:①受體細胞或組織的準備和預處理;②DNA微彈的製備;③受體材料的轟擊;④轟擊後外植體的培養和篩選。

基因槍轉化率差異很大,一般在10-3~10-2之間。但有的報導其轉化率高達2.0%,而有的報導僅有10-4。相對於農桿菌介導的轉化率要低得多。而且基因槍轉化成本高;嵌合體比率大;遺傳穩定性差。此外,通過基因槍法整合進植物細胞基因組中的外源基因通常是多拷貝的,可導致植物自身的某些基因非正常表達,還可能發生共抑制現象(co-suppression)。即使這樣,該方法得到了廣泛套用,因其具有如下優點:①無宿主限制,無論是單子葉植物和雙子葉植物都可以套用;②可控度高,操作簡便迅速,商品化的基因槍都可以根據實驗需要調控微彈的速度和射入濃度,命中特定層次的細胞;③受體類型廣泛,原生質體、葉圓片、懸浮培養細胞、莖、根、以及種子的胚、分生組織、愈傷組織、花粉細胞、子房等幾乎所有具有分生潛力的組織或細胞都可以用基因槍進行轟擊;④可將外源基因導入植物細胞的細胞器,並可得到穩定表達。正因為基因槍這些優點,使基因槍成功的套用於植物基因轉化,特別是單子葉植物的轉化;外源基因導入植物細胞器等。

影響因素

1)不同濃度的CaClz對基因瞬時表達和穩定表達的影響。

2)添加亞精胺溶液與未加亞精胺的轟擊對基因瞬間表達影響不大。

3)太高的氦氣壓力會對細胞造成不可逆的損傷。

4)轟擊次數對愈傷組織轉化的影響很小。

5)細胞處於不同的生理狀態,初生愈傷組織細胞的結構緊密,細胞核大,質濃,而繼代3個月後的愈傷組織逐漸老化,細胞液泡化程度高。

6)在基因槍轉化前24h分別用5、10、20Gy丁射線輻照處理愈傷組織。5Gy處理的基因瞬時表達明顯增強,抗性愈傷比例比對照提高近l倍。

套用

腫瘤基因治療研究中的套用

基因槍在腫瘤基因治療的研究主要在間接體外和體內兩個領域。間接體外領域主要是瘤苗的研究,即在間接體外對腫瘤細胞轉基因,經過照射使之失去增殖能力後,再回植到體內,以達到提高機體抗腫瘤免疫的能力。

由於患者腫瘤手術切除標本非常難於在體外長期培養,而且即使獲得長期培養物,腫瘤細胞表面存在的一些抗原性物質也可能已經發生了改變。所以,基因槍這種不需要長期體外培養的轉基因手段在這些研究中具有很大的優勢。

植物基因轉化中的套用

目前,農作物基因工程正進入一個飛速發展的時期,越來越多的轉基因植物和產品進入市場。不但可以利用基因槍技術種植具有特定農藝性狀(如抗病、抗旱、抗寒、抗澇、抗蟲、耐鹽、耐藥等)以及高質量食品(高蛋白、高油酸、含維生素等)的作物,而且也可以利用該技術來開發和利用具有特定用途(如生物製藥)的植物。總之,有了這種高效的轉化技術,作物複雜的生理生化性狀等可望得到進一步的改良。

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