四區劃線法

用接種環在平板培養基表面通過分區劃線而達到純化分離微生物的一種方法。 (1) (3)

原理
四區劃線分離法是指把混雜在一起的微生物或同一微生物群體中的不同細胞用接種環在平板培養基表面通過分區劃線稀釋而得到較多獨立分布的單個細胞，經培養後生長繁殖成單菌落，通常把這種單菌落當作待分離微生物的純種。有時這種單菌落並非都由單個細胞繁殖而來的，故必須反覆分離多次才可得到純種。其原理是將微生物樣品在固體培養基表面多次作“由點到線”稀釋而達到分離目的的。
劃線的形式有多種，可將一個平板分成四個不同面積的小區進行劃線,第一區(A區)面積最小，作為待分離菌的菌源區，第二和第三區(B、C區)是逐級稀釋的過渡區，第四區(D區)，則是關鍵區，使該區出現大量的單菌落以供挑選純種用。為了得到較多的典型單菌落,平板上四區面積的分配應是D＞C＞B＞A。
步驟:
用接種環在平板培養基表面通過分區劃線而達到純化分離微生物的一種方法。是將微生物樣品在固體培養基表面多次作“由點到線”稀釋而達到分離的目的。用於目的微生物的分離。
特點：快捷、方便、便於得到目的性狀的單克隆。
示例： 對大腸桿菌的分離
實驗器材
大腸桿菌、枯草芽孢桿菌混合菌懸液
牛肉膏蛋白腖培養基
無菌培養皿，水浴鍋，接種環等。
實驗步驟
1．融化培養基：牛肉膏蛋白腖瓊脂培養基放入水浴中加熱至融化。
2．倒平板：待培養基冷卻至50℃左右，按無菌操作法倒2隻平板(每皿約15m1)，平置，待凝固。
倒平板的方法：右手持盛培養基的試管或三角瓶置火焰旁邊，用左手將試管塞或瓶塞輕輕地撥出，試管或瓶口保持對著火焰；然後用右手手掌邊緣或小指與無名指夾住管(瓶)塞(也可將試管塞或瓶塞放在左手邊緣或小指與無名指之間夾住。如果試管內或三角瓶內的培養基一次用完，管塞或瓶塞則不必夾在手中)。左手拿培養皿並將皿蓋在火焰附近打開一縫，迅速例入培養基約15m1，加蓋後輕輕搖動培養皿，使培養基均勻分布在培養皿底部，然後平置於桌面上，待凝後即為平板。
3．作分區標記在皿底將整個平板劃分成A、B、C、D四個面積不等的區域。各區之間的交角應為120℃左右（平板轉動一定角度約60℃），以便充分利用整個平板的面積，而且採用這種分區法可使D區與A區劃出的線條相平行，並可避免此兩區線條相接觸。
4．劃線操作
(1) 挑取他含菌樣品：選用平整、圓滑的接種環，按無菌操作法挑取少量菌種。
(2) 劃A區：將平板倒置於煤氣（酒精）燈旁,左手拿出皿底並儘量使平板垂直於桌面，有培養基一面向著煤氣燈(這時皿蓋朝上，仍留在煤氣燈旁)，右手拿接種環先在A區劃3—4條連續的平行線(線條多少應依挑菌量的多少面定)。劃完A區後應立即燒掉環上的殘菌，以免因菌過多而影響後面各區的分離效果。在燒接種環時，左手持皿底並將其覆蓋在皿蓋上方(不要放入皿蓋內)，以防止雜菌的污染。
(3) 劃其他區：將燒去殘菌後的接種環在平板培養基邊緣冷卻一下，並使B區轉到上方，接種環通過A區(菌源區)將菌帶到B區，隨即劃數條緻密的平行線。再從B區作C區的劃線。最後經C區作D區的劃線，D區的線條應與A區平行，但劃D區時切勿重新接觸A、B區，以免極該兩區中濃密的菌液帶到D區，影響單菌落的形成。隨即將皿底放入皿蓋中。燒去接種環上的殘菌。
5．恆溫培養：將劃線平板倒置，於37℃（或28℃）培養，24hr後觀察。