巴甫洛夫在研究消化生理學的最後一段時間裡，觀察到動物看到和嗅到食物即流涎、產生唾液和胃液的“心理性”分泌。這一現象就是我們平常所說的“饞得流口水”。為什麼會發生“饞得流口水”這一現象？有人唯心地斷定，那是因為狗與人一樣有思想，它想吃，它希望吃，所以流口水；也有人認為，心理作用是靈魂活動，它是不可知的，不僅現在，將來也永遠弄不清，但這一現象卻促使巴甫洛夫開始對高級神經活動生理學進行研究。
巴甫洛夫的同事格林斯基於1895年重新改進了1979年第一次實施地唾液腺瘺管裝置。手術僅用了15分鐘。一系列的實驗證明：動物看到食物和嗅到食物就已經能引起要求消耗一定濃度和數量食物的流涎。這種現象成為巴甫路夫研究無條件反射和條件反射的出發點。
1903年，巴甫洛夫出席在西班牙馬德里舉行的國際醫學會議，作了一個題為《動物實驗心理學和精神病理學》的報告，正式宣布了自己的決心和企圖：用生理學的科學實驗方法，來研究心理現象和大腦兩半球的活動規律。這是一個數千年來科學所沒有解決的重要問題。從第二年開始，巴甫洛夫就致力於研究反射和人的高級神經活動，一直到他生命的最後時刻。在長達35年時間內，巴甫洛夫為了這個任務堅持不懈地努力，終於取得了重大的勝利。
19世紀許多學者已經確定了精神活動就是中樞神經系統高級部位的機能，但是這種見解基本上帶有直觀的性質，沒有經過直接的可靠的實驗材料所論證。究竟怎樣去認識腦在起作用，其活動規律怎樣，什麼樣的過程是這一活動的基礎，這種過程的發生情況怎樣等都還沒有找到真正的答案，研究腦機能的生理學家都處於困惑狀態中。巴甫洛夫說：“我們有權利這樣說，從伽利略時代開始的勢不可擋的的自然科學進程，第一次在腦的高級部位面前，或者一般地說，在動物與外在世界發生極其複雜關係的那個器官面前，顯著地停頓下來了。這並不是沒有原因的，這是自然科學的真正危急的關頭，因為創造過並正在創造著自然科學的那個發展到高級形態的腦――人腦本身也變成了這一自然科學的研究對象了。”
巴甫洛夫吸取了達爾文的進化論和“俄國生理學之父”謝切諾夫的“反射論”的精華，系統地進行研究，他以狗和猿做實驗對象，作了一系列各種不同的實驗。研究開始時，巴甫洛夫對他暫時地稱“心理性”的唾液分泌現象作了種種推測，並提出了一個比較合理的解釋：“難道這種現象不是一種反射作用嗎？它很可能是一種特殊類型的反射作用。”
反射這一概念是法國哲學家和自然科學家笛卡爾在巴甫洛夫出生前二百年提出的。笛卡爾認為，動物機體的每一種活動，都是對外界剌激的必然反應，而這些反應，是通過神經系統實現的。這種反應就叫反射。謝切諾夫認為，人類的意識也是一種反射活動，並企圖嘗試用生理學解釋心理現象產生的方式。他的著作《腦的反射》是巴甫洛夫條件反射學的先聲。但是，謝切諾夫的論述在當時並沒有實驗證明。
巴甫洛夫從謝切諾夫的論點出發。按照謝切諾夫的論點，動物和人都具有一種天生的、同現有解剖反射路線相合的、而且在出生時就具有充分功能能力的反射。比如，嬰兒生下來會吮奶、吞咽、手指碰到燙的東西會馬上縮回，睛眼突然看到強光瞳孔會縮小，食物進口會分泌唾液等等。這些都是人和動物先天就有的本能，不需要任何訓練，而且能一直保持下去。巴甫洛夫把這類先天性反射稱之為“非條件反射”。
除了“非條件反射”以外，巴甫洛夫又發現了另一類反射，既獲得性反射。這種獲得性反射只有在個體發育期間才能形成。比如，只要把肉放在狗的面前，並沒有讓它吃到嘴裡，狗就會流口水。巴甫洛夫認為，這是因為狗在以前多次吃肉的時候，首先看到了肉的形狀，嗅到了肉的氣味，然後，當肉進入嘴裡時，味覺器官嘗到肉的味道，便引起了非條件反射的唾液分泌。視覺、嗅覺、味覺器官所受到的剌激傳入中樞，在狗的大腦皮層的不同區域，形成三個興奮灶。久而久之，這三個興奮灶之間的聯繫漸漸加強，得以鞏固，以致肉的形狀和氣味一旦在狗面前出現，就可以如同肉已經吃到嘴裡一樣，引起唾液分泌的反射。這一類反射是後天形成的，巴甫洛夫把它稱做“條件反射”。這就是所謂“心理性”分泌的生理過程。
條件反射不可能是先天就有的。巴甫洛夫做過這樣的實驗，他把肉投給一隻出生後只吃奶而從來沒吃過肉的狗，這隻狗不僅不分泌一滴唾液，而且僅僅用鼻子嗅嗅，觀察觀察就走開了。巴甫洛夫把肉突然送到這隻狗的嘴邊，這隻狗不但不張嘴來咬肉，反而把頭轉過去，避開了肉。
非條件反射是永存的，而條件反射則不是永存。如果生活條件有所變化，舊的條件反射便會消退，而新的條件反射又可以建立起來。巴甫洛夫是這樣實驗的，狗看到肉會流口水，巴甫洛夫就重複地只讓狗看到肉而不讓狗吃肉，結果是狗的唾液分泌會一次比一次減少，到後來，竟然一點都不分泌了。因此可見，條件反射的形成，發展與消退，能使動物對於它的生活條件和周圍環境有更靈活和更精確的適應能力。
巴甫洛夫為了證實他的條件反射學說，科學地測定唾液分泌的情況，他在狗的頰部開刀，造成一個瘺管。狗的口腔里一共有三條唾腺：腮腺、頜下腺和舌下腺。巴甫洛夫把兩個腮腺中的一個造成瘺管，瘺管的開口通往一個儀器，這是一台可以測出十分之一滴唾液分泌的高度靈敏的儀器。在具體實驗的時候，讓狗與外界的聲和光等隔絕，只接受研究人員給予的剌激信號。實驗的結果發現，至多只要幾十次，就能使狗形成對某一信號的條件反射。
巴甫洛夫用與食物無關的條件如鈴聲或燈光來剌激狗，狗決不會見到燈光或聽到鈴聲而分泌唾液。但若把鈴聲或燈光和食物聯繫在一起，即每次給狗餵食物時鈴聲響起來，或燈光亮起來，這樣的實驗少則幾次，多則十幾次，幾十次後，即使不給狗吃食物，只要鈴聲響起來或燈光亮起來，就會使狗的唾液腺產生反應，分泌唾液。這是因為燈光或鈴聲造成的視覺剌激或聽覺剌激和食物造成的味覺剌激，在大腦皮層里建立了暫時性的聯繫，所以狗對燈光鈴聲產生了條件反射。
剌激信號不僅僅是鈴聲和燈光，就連腳步聲、流水聲、甚至用棍子打狗、用烙鐵燙狗、用針剌狗，只要同食物聯繫在一起，就都會形成條件反射，以致於狗挨了打、燙或剌、就立刻會垂涎三尺。因為狗對於剌激信號非常靈敏，經過特殊訓練的狗這方面的能力更獨特，警犬能毫無困難地分辨出多至50萬種以上不同的氣味。對警犬的訓練就是套用了巴甫洛夫的條件反射學說。
無數次的實驗證實了條件反射學說。巴甫洛夫發現了“條件反射”，就是發現了動物界和我們人類本身的基本的、同時也是最普通的現象。巴甫洛夫說：“在狗身上試驗唾液腺的反射，等於狗把許多事情告訴了我們。”
人為的實驗可以製造某一重複剌激，作為形成條件反射的信號。動物或人類在自然界中，又是怎樣從許多剌激中找出一些具有信號意義的剌激來呢？研究表明，條件反射是由“內在和外在環境中的各種各樣的初級的或最複雜的複合動因形成的，不過要受一種限制：為了感知這一切動因，在大腦半球中就必須有感受的要素”。巴甫洛夫認為，這主要是依靠大腦皮層的功能。他認為，條件反射是以非條件反射為基礎形成的，可以構想在條件反射形成後，條件剌激的神經通路和非條件反射的神經通路之間必定發生一種新接通的暫時聯繫，暫時聯繫發生在大腦皮層的有關中樞神經之間，即在條件剌激的皮層興奮灶與非條件剌激的皮層興奮灶之間，由於多次結合強化，而建立了暫時聯繫，所以巴甫洛夫說：“外部動因與機體對外部動因所作的反應活動之間的經常聯繫理應叫做非條件反射，暫時性聯繫則應叫做條件反射。”巴甫洛夫認為，條件反射的一個極其重要特點就是反射的暫時性。
巴甫洛夫把感受器、傳入神經纖維和相應的中樞神經部分比做簡單的分析器。感受器官只具備初步的分析能力，每一種感受器官只能接受一種性質的刺激，如眼睛對光線，耳朵對聲音，舌頭對味道；當它們接受了一定的刺激後，就通過神經纖維傳達到神經中樞的某個低級部位――這部位在腦幹內，從而引起一定的動作，例如：眼睛遇到強光會縮小瞳孔，舌頭一嘗味道就會分泌唾液。這些都是簡單的反射，也就是非條件反射。但是，大腦兩球皮層好象是一個靈敏度極高的分析器總體，它能把刺激的強度和性質分析得很精細，同時也能把不同部位、不同強度以及不同時間出現的刺激，給以很好的綜合，形成一個總的複合刺激，因而也就能引起各種各樣極其複雜的反射，就是巴甫洛夫所說的條件反射。
巴甫洛夫通過實驗來證實大腦皮層的功能。他用精細的手術把一隻狗的大腦皮層（灰質）切除，而保留神經中樞的其餘部分。結果，便製造了一個具有明顯行為缺陷的嚴重的“殘廢者”。在這隻狗身上屬於非條件反射的本能行為都還存在，它仍然會走會跳，會吃食物，甚至也能生育；但是，在這隻狗身上原先已建立起來的舊的條件反射則完全喪失了，而新的條件反射無論如何也建立不起來了。這隻狗不再認識它的主人了，主人撫摸它，它無動於衷，恐嚇它也不逃走；把食物放在它的面前它也不知道吃，根本也不流口水；它走來走去，到處亂嗅，不會根據食物的信號去找食物，只有當嘴巴偶然碰到食物時或把食物放入在它嘴裡，它才會吃下去，如果沒有人工飼養，這隻狗必定會餓死無疑。所以實驗證明：條件反射是大腦皮層的反射活動，是一種典型的大腦活動，是大腦複雜規律的一個基本環節。
巴甫洛夫的條件反射學說的生物學意義在於：他具體地、科學地闡明動物機體如何同它的周圍環境建立精確的相互關係，根據對生命活動有的或不利的不同剌激信號，決定其行動，產生精確的反應，使動物機體本身更適應於生存環境，生存下去。動物在自然環境中會根據食物的信號（氣味、顏色、形狀等）去尋找食物，不是等待食物送上門來，掉到自己嘴裡。動物也會根據危險的信號而避開危險，以保存自己的生命。儘管猛獸的形體和聲音對於小動物來說不是致命的東西，但猛獸的爪和牙則可以毀滅小動物，如果弱小動物非要在猛獸的爪和牙接觸到自己身上時才開始反應，那就太晚了。因此小動物在得到猛獸的形體和聲音的信號時就要有所反應才能得到保護。當環境改變時，動物也會隨著環境的變化而形成新的條件反射，來適應新的環境。
巴甫洛夫的條件反射學說在哲學上也具有重大的意義，條件反射學說同巴甫洛夫以後提出的兩個信號系統學說有力地證明了這樣一個觀點：人的主觀意識是客觀現實在人腦中的反映。巴甫洛夫以自己的科學研究成果為辯證唯物主義認識論提供了充分的自然科學基礎。
