“分子生物學”一詞最早是由洛克斐勒基金會的瓦倫·韋弗於1938年創造,意指一個以物理學及化學來解釋生命的概念。此概念的可行性,來自1910年代孟德爾遺傳學的重新見世,以及1920年代原子論及量子力學的成熟。有許多研究者關注於生物學、化學以及物理學之間的交叉,例如後來將焦點轉移到生物學的尼爾斯·玻耳以及埃爾溫·薛丁格。此外,從1930年代到1940年代之間,膠體化學、生物物理學以及放射生物學、晶體學等學門也漸趨成熟。
1940年,喬治·畢多與愛德華·塔特姆證明了基因與蛋白質之間的關係,因此而聯繫了生物化學與遺傳學。他們所建立的模式生物粉色麵包霉菌(Neurospora crassa),成了後來的分子生物學發展主題。1944年,紐約洛克斐勒研究院的奧斯瓦爾德·埃弗里,證明基因是由DNA所組成。阿弗雷德·赫希與瑪莎·蔡斯更於1952年確認了噬菌體的遺傳物質為DNA。1953年,詹姆斯·沃森與佛朗西斯·克里克基於羅莎琳·富蘭克林及莫里斯·威爾金斯的研究,發現了DNA雙螺旋結構。
到了1961年,方斯華·賈克柏與賈克·莫諾,提出了一個學說,認為DNA與蛋白質之間具有一種稱為mRNA的中介物。於1961年到1965年間,DNA所儲藏的遺傳訊息與蛋白質的關係逐漸明朗,研究發現遺傳密碼決定了DNA的核苷酸與蛋白質的胺基酸序列之間的關聯性。1960年代初期,賈克柏與莫諾闡明了某些蛋白質調節轉錄作用的機制。之後的10多年則開始出現許多分子生物學的套用,如遺傳工程等。
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