凝血調節素

凝血調節素

凝血酶調節蛋白(Thrombomodulin,TM)不僅是重要的抗凝輔助因子,也是反映血管內皮細胞損傷的分子標誌物,與許多疾病的發生髮展有著密切聯繫。Salem等曾從5kg胎盤組織中提取了0188mg的TM1。提取過程中需要以凝血酶為配基的親和層析,費用極其昂貴。TM的cDNA鹼基序列已經被測定2。TM基因的基礎研究為TM部分結構域蛋白
質的表達提供了非常有利的條件。我們採用基因工程技術,原核表達目的蛋白,將原核表達蛋白免疫BALBPC小鼠,從而繞開天然TM的提取、純化過程,進行TM抗體製備。

介紹

驗室保存;重組表達質粒pQE31PTMLec155為本實驗室構建。
羊抗鼠IgG2HRP為本室標記(工作濃度為1∶1000),人胎盤組織由上海第二醫科大學附屬瑞金醫院婦產科提供,Ni2NTAAgarose及其提純試劑購自上海申能博彩生物科技有限公司,EVC2304(人臍靜脈內皮細胞原代培養)購自中國科學院上海細胞研究所細胞庫,其他試劑均購自Sigma公司。

方法

凝血調節素

重組質粒pQE31PTMLec155的表達　將pQE31PTMLec155轉化入表達宿主菌M15,在同時含有氨苄青黴素(100μgPml)和卡那黴素(20μgPml)LB平板上培養;挑選的陽性菌落在液體培養基中搖長,加1mmolPLIPTG誘導表達4小時,6000rPmin離心10分鐘收集菌體,經超聲破碎後進行SDS2PAGE分析。11212　Westernblot鑑定TMLec155目的蛋白細菌裂解液經1215%SDS2PAGE電泳,電轉移至NC膜上。加入羊抗人TM多抗(1∶200),室溫反應1小時,PBS
漂洗後加入兔抗羊IgGPHRP二抗,室溫反應1小時,顯色。

誘導蛋白的純化　按Ni2NTAAgarose試劑說明書操作並稍作改動。

純化後誘導蛋白的重摺疊　參照文獻3,簡述如下,調整變性條件下從包涵體中純化的蛋白質濃度為015mgPml,在015molPLTris(pH719),10%蔗糖,1%甘氨酸中緩慢透析去除變性劑,使蛋白復性。