cgh[比較基因組雜交]

CGH是比較基因組雜交（comparative genomic hybridization）的英文縮寫，是一種分子細胞遺傳學技術。

概念

CGH即比較基因組雜交（comparative genomic hybridization，CGH），是自1992年後發展起來的一種分子細胞遺傳學技術，它通過單一的一次雜交可對某一腫瘤整個基因組的染色體拷貝數量的變化進行檢查。其基本原理是用不同的螢光染料通過缺口平移法分別標記腫瘤組織和正常細胞或組織的DNA製成探針，並與正常人的間期染色體進行共雜交，以在染色體上顯示的腫瘤與正常對照的螢光強度的不同來反映整個腫瘤基因組DNA表達狀況的變化，再藉助於圖像分析技術可對染色體拷貝數量的變化進行定量研究。

基本原理

CGH是一種將消減雜交和FISH相結合，用於檢測兩個（或多個）基因組間相對DNA拷貝數變化（如擴增、增益（gains）、複製和丟失等），並將這些異常定位在染色體上，因此又稱DNA拷貝數核型（DNA copy number karyotype）技術。與傳統的原位雜交方法相反，該法不是將單一的、已定的DNA探針雜交在受檢的分裂中期或間期的細胞上，而以被檢組織的基因組DNA為雜交檢測樣本，正常組織的DNA樣本為參照，分別用不同顏色的螢光標記，兩者按1∶1混合，與正常淋巴細胞中期染色體進行雜交（即反向原位雜交），再通過檢測兩種顏色的螢光強度，根據顏色的比例來顯示基因組的結構狀況。如果探針中某一染色體或染色體亞區呈現過度表達或低表達，則在正常染色體的相應區域內便呈現較強或較低的信號，表明該區域存在DNA序列的增益或丟失。

基本方法

隨著CGH技術的廣泛套用，其操作方法已逐步完善，經驗表明，CGH技術的建立和常規套用，對每一步操作都必須細緻。CGH的主要步驟包括：（1）正常中期染色體的製備；（2）從腫瘤組織中分離高分子量的基因組DNA；（3）用不同的haptens標記正常和腫瘤DNA；（4）標記的DNA與正常中期染色體原位雜交；（5）螢光顯微鏡檢查和數位化圖像分析；（6）對中期染色體產生的綠紅螢光密度比率相對應的拷貝數異常進行分析。

(1) 正常中期染色體的製備

正常中期染色體充當CGH雜交的靶，CGH分析的質量主要依賴中期染色體的特性，中期染色體的製備採用常規PHT刺激和氨甲喋呤同步化處理的外周血淋巴細胞培養技術，一次應製備大量片子，以保證整個實驗都使用同一批片子。此外，對製備的中期染色體玻片應選擇重疊較少，形態保持較好，染色體較長的標本。

( 2) 腫瘤標本的選擇和基因組DNA的分離

分離DNA的標本應儘可能的選擇具有典型腫瘤組織學特徵和比例高的惡性細胞，棄除壞死組織和炎症區域及周邊正常細胞，因其中含有壞死細胞降解的DNA和一些正常細胞，可顯著消弱拷貝數改變的分辨能力。從腫瘤細胞和組織中提取高分子量DNA的方法均可用於CGH。福馬林固定、石蠟包埋切片亦可獲得相對高分子量的DNA，由於石蠟包埋組織提取的DNA濃度不足進行直接標記缺口平移法（nick translation），因此腫瘤DNA套用兼併引物PCR（degenerate oligonucleotide-primed PCR, DOP-PCR）擴增和標記，採用通用引物PCR（UN1-primer, 5’-CCG ACT CGA GNN NNN NAT GTG-3’， N=A，C，G或T）擴增和標記。

( 3) 正常和腫瘤DNA的標記

基因組DNA的標記可採用缺口平移法、隨機引物法（random priming）和DOP-PCR等技術，通常採用生物素-14-dATP標記腫瘤DNA，地高辛-11-dUTP標記正常DNA，亦可用直接螢光素連線核苷酸，如FITC-dUTP和Texas Red-dUTP。與著絲粒和粘粒探針相比，缺口翻譯法後的基因組探針片斷長度範圍在600～2000 bp，在缺口翻譯反應中可通過調整DNase和DNA聚合酶的比例獲得相應的DNA片斷長度。

(4) CGH雜交和染色

CGH雜交和染色基本遵循粘粒探針的染色體塗染和FISH技術，雜交中將一定比例不同標記的檢測和參照DNA混合，並加入Cot-1 DNA以阻斷重複序列對雜交結果的干擾，特別是近端著絲粒和異染色質區的比率改變。為了獲得足夠的DNA濃度，標記的DNA和阻斷的DNA應充分混合。每次雜交前的變性時間和溫度、蛋白酶K的量均不一樣，應適應調整以達到最完全的變性和最佳探針穿透，但應避免破壞DAPI帶型，一般在37℃濕度的小室中覆以蓋玻片雜交2～4天，按照標準的FISH技術洗掉未結合的探針，如果用間接法標記探針時，用FITC（腫瘤DNA呈綠色螢光）和抗地高辛-羅丹明（正常DNA呈紅色螢光）免疫組化染色。

( 5) 螢光鏡檢和多彩數字圖像分析

CGH分析主要依賴兩種螢光素的相對強度，由多彩螢光顯微鏡和計算機多彩圖像分析儀將螢光信號進行定量處理，評價沿染色體長軸分布的兩種螢光信號強度的相對比值，如果某一染色體區域的檢測DNA螢光強度信號明顯增強，表明所檢測的樣本DNA相對於參照DNA序列發生增益，而參照DNA的螢光強度信號相對增強，則提示檢測DNA樣本發生丟失。判斷CGH質量的標準包括：（1）所有中期染色體具有平穩的高強度雜交；（2）在一個染色體的兩個姐妹染色單體的綠/紅螢光分布相似，一般正常的變異標準應小於0.85～1.15，而端著絲粒和異染色質區常超過這個範圍，故一般不作分析；（3）染色體外周背景螢光水平低且一致；（4）染色體的端著絲粒和異染色質區連線的標記DNAs較低；（5）染色體呈現強烈的DAPI染色，可見的條帶、足夠的長度和微小的重疊。

套用

CGH已廣泛套用於人體各種腫瘤的研究，晚近的資料表明，已對20000餘例腫瘤的基因組熱點重排、拷貝數目的異常、編碼的基因、以及與腫瘤的發生髮展、診斷、分類和預後的關係進行了研究，這對於加深腫瘤分子生物學的理解具有重要意義。

( 1) 腫瘤染色體區DNA增益和丟失

研究表明在許多惡性腫瘤如乳腺、卵巢、前列腺和肺癌染色體區1q、3q和8q常發生增益，而8p、13q、16q和17p常發生丟失。在睪丸癌發生12p和Xp增益，腎癌發生14q丟失，卵巢癌發生Xp丟失。這些特異位點的丟失反映了在癌發生過程中的獨特性。為了評價惡性實體腫瘤遺傳物質的增益和丟失，Mertens等〔6〕選擇文獻報告的11種腫瘤，根據508例乳腺癌、447例惡性神經性腫瘤、435例腎癌、333例結腸癌、304例卵巢癌、303例肺癌、209例睪丸生殖細胞腫瘤、206例頭頸部癌、172例惡性黑色素瘤、142例Wilm瘤和126例成神經細胞瘤的細胞遺傳學信息，對每一染色體的失衡進行計算，發現所有腫瘤的增益和丟失都有其獨特的失衡分布，然而，不同類型的腫瘤也具有相當大的重疊，提示許多腫瘤的發生具有相似的分子機制，所有腫瘤的丟失程度明顯高於增益，大多數腫瘤存在染色體X、Y、4、10、13～15、18和22以及染色體片斷1p22-pter、3p13-pter、6q14-qter、8p、9p和11p的丟失。肺小細胞癌的染色體3q(85%)、5p(70%)、7p（70%）、7q（65%）和8q（65%）常發生信號增強，也見於1q、2p和20p；3q26、8q24、3q28-qter、7q11.2、8p11-12、12p12和19q13.1-13.2較常發生增益。而最常發生信號減弱的染色體是3p21, 8p21-pter、15q11.2-13、5q11.2-15、9p、13q12-14、17p和18q21-qter常發生丟失。

(2) 明確DNA增益和丟失的靶基因

CGH可精確定位腫瘤基因，特別是發生DNA增益的染色體位點。研究表明在一些腫瘤中存在多種染色體亞區增益或DNA拷貝數擴增。已發現乳腺癌高達30個染色體亞區參與增益和丟失，顯著高於用癌基因特異DNA探針定位的結果。Morchio等對50例伴HBV感染的進展期肝細胞癌（HCC）進行CGH，發現染色體臂4q(70%)和8p（65%）最常發生丟失，該丟失位於4q21和8p21-23的微小重疊區，以往研究發現在高分化HCC 4q21-22區完全丟失是一繼發事件，其可增加已發生腫瘤的侵襲力，此區亦是HBV整合的部位；RFLP研究顯示在8p21.3-22含有PRLTS基因（PDGF受體β樣腫瘤抑制基因）。染色體臂16q(54%)、17p(51%)、13q(37%)、6q（37%）和1p36（30%）亦證實有丟失，在23%～85%的HCC發生含E-cadherin基因的16q21-24區丟失；染色體13q存在兩個丟失區，分別含有RB1（13q14）和BRCA2（13q12）腫瘤抑制基因。染色體臂8q(60%)、1q(58%)、6p(33%)和17q(33%)頻繁發生增益，最小重疊區定位於1q11-25和8q22-24，在許多腫瘤包括HCC頻繁發生1p36的丟失，認為此區可能含有一個腫瘤抑制基因，1q的頻繁擴增也提示存在一個癌基因參與癌的發生過程；此外在11q12、12p11、14q12和19q13.1也發現有擴增。對這些丟失或增益區分離克隆將可發現新的癌基因和腫瘤抑制基因。

(3) 腫瘤的分期與分級 Bockmuhl等套用

CGH對29例轉移性（pN+）和19例非轉移性（pNO）頭頸部鱗形細胞癌研究發現，pNO腫瘤染色體5p、6p和7p過度表達，而pN+腫瘤頻繁發生染色體7q、10q、11p、11q、15q和20p的丟失以及染色體19q和20q的過度表達，轉移性癌的染色體10q25-q2611和p13-p14的丟失顯著增高，微衛星多態物雜合性分析亦證實染色體10q的異常，表明這種獨特的遺傳學改變與頭頸部鱗形細胞癌的轉移表型有關。Weber等〔10〕套用CGH對19例良性（WHOⅠ級，MⅠ）、21例不典型（WHOⅡ級，MⅡ）和19例間變型（WHOⅢ級，MⅢ）散發的腦膜瘤染色體失衡掃描發現，隨著惡性程度的增加，染色體遺傳學異常明顯增多，每個腫瘤總的數目改變分別為2.9±0.7、9.2±1.2和13.3±1.9，在MⅠ最常發生的改變是22q丟失；在MⅡ腫瘤組織的1p（76%）、22q(71%)、14q(43%)、18q(43%)、10q(33%)和6q（33%）常發生丟失，20q（48%）、12q（43%）、15q（43%）、1q（33%）、9q（33%）和17q（33%）常發生增益；在MⅢ腫瘤組織除與MⅡ相似的發生頻率外，6q（53%）、10q（68%）和14q（63%）的丟失頻率增加，9p的丟失為32%，4/16（25%）的MⅢ腫瘤組織發現在9p21位點CDKN2A的純合性丟失，1例MⅡ和8例MⅢ腫瘤組織存在17q23的DNA序列擴增，儘管所有Ⅱ、Ⅲ級腫瘤組織存在高頻率的染色體異常，均無1例發生TP 53外顯子5～8的突變，推測腫瘤基因組的異常可能與腦膜瘤的進程有關。

優點

CGH技術的優點：1.實驗所需DNA樣本量較少，做單一的一次雜交即可檢查腫瘤整個基因組的染色體拷貝數量的變化。2.此法不僅適用於外周血、培養細胞和新鮮組織樣本的研究，還可用於對存檔組織的研究，也可用於因DNA量過少而經PCR擴增的樣本的研究。

CGH技術的局限性：CGH技術所能檢測到的最小的DNA擴增或丟失是在2Mb,擴增解析度10-20Mb，故對於低水平的DNA擴增和小片段的丟失會漏檢。此外在相差染色體的拷貝數量無變化時，CGH技術不能檢測出平衡染色體的易位（就是姐妹染色單體同源序列的互換）。