離子淌度質譜

離子淌度質譜是離子淌度分離與質譜聯用的一種新型二維質譜分析技術，離子淌度分離原理是基於離子在飄移管中與緩衝氣體碰撞時的碰撞截面不同，離子可按大小和形狀進行分離。經過30多年的發展，離子淌度質譜已配有多種最新的離子源及質量分析器，理論研究也日漸成熟，並在蛋白質、多肽及複雜化合物異構體分析方面越發顯示出獨特的優勢，正在發展成為一種新型的重要分析工具。
20世紀80年代後，由於各種軟電離技術相繼問世，質譜(mass spectrometry，MS)的套用拓展到對高極性、難揮發和熱不穩定的生物大分子的分析研究，發展成為生物質譜，並迅速成為現代分析化學最前沿的領域之一 。離子淌度質譜(ion mobility mass spectrometry，IMMS)是離子淌度光譜(ion mobility spectrometry，IMS)技術與質譜的聯用。是一種新型的二維分離質譜技術。IMS技術出現於20世紀70年代，由於其具有多樣性的分析能力、良好的檢測限及實時的檢測能力，在當時受到人們廣泛關注，但由於IMS解析度較低且不能給出離子質量信息，加之當時人們對離子組成的重要性缺乏理解，因此在1976年以後，有關離子淌度的研究逐漸減少。直到20世紀80年代末，特別是以MALDI和ESI 為代表的各種軟電離方法套用以來，IMS在化合物異構體分離方面具有的獨到優勢才又引起了人們的關注，相繼推出了配備各種新型離子源的IMS—MS聯用技術，精確的離子幾何形狀和淌度計算方法得到飛速發展，IMMS技術有了實質性進展。目前，IMMS已經用來檢測化學戰劑、爆炸物 、環境污染 、麻醉劑 、半導體及生物大分子(如肽和蛋白質類)，並顯示出其強大的分析能力。
1 原理與儀器組成
1．1 IMMS基本原理
離子淌度(ion mobility，IM)，又稱離子遷移率，是指在電場強度為1 V／m或電場力為1N時正離子或負離子的運動速度，單位為m ／V。在IMS中，離子受電場力加速的作用向前運動，運動中又與飄移區緩衝氣體分子發生碰撞產生阻力使速度降低。碰撞過程中離子失去的動能可轉化為內能使離子溫度升高，再次的碰撞又可將升高的內能傳遞給氣體分子，回復到系統溫度 。因此，離子在運動過程中溫度和速度並不保持恆定。離子之間、離子與緩衝氣體之間也可能存在著靜電引力與庫侖斥力，決定了離子在飄移區的運動過程是極其複雜的，只能由其平均速度(即離子淌度 )或離子通過飄移區的時間td來計量。這種分離過程與色譜的分離過程類似，因此IMS在早期又被稱為電漿色譜(plasmachromatography，Pc)。為了使不同實驗條件下的測量值能夠相互比較，在實際套用中通常將離子淌度轉換為折合離子淌度(reduced ionmobility， )，即在溫度為273 K，壓力為760 tort的條件下的離子淌度，離子的大小和形狀可用離子與緩衝氣體發生碰撞時的平均可用截面即碰撞截面(collision Cross section，n)來衡量。由上述可知，離子淌度分離主要是基於離子的形狀和大小。因此，對於用常規質譜方法不能區分的異構體或複合物等分析，這種分離手段具有獨特優勢。離子按淌度預分離後，再通過每一組分質荷比求得質量數，便可獲得離子淌度質譜二維圖譜或三維圖譜(圖1)。
1．2 儀器組成
離子淌度質譜儀與常規質譜儀的主要區別在於前者在離子源和質量分析器之間增加了一個離子飄移管。離子飄移管通常由不導電的高純度氧化鋁製成，中間鑲嵌若干不鏽鋼環，不鏽鋼環之間以高溫電阻相連，兩端不鏽鋼環之間施加驅動離子前進的電場。質量分析器可採用四極質量分析器或飛行時間質量分析器，由於四極分析器掃描離子費時較長，現在IMMS分析器多為飛行時間質譜(TOF—MS)。儀器中飄移管部分通以緩衝氣體，質量分析器部分採用高真空，二者之間配以由錐體和離子透鏡組成的接口。典型的離子淌度質譜的組成見圖2。由於離子在飄移管中通過的時間為毫秒級，在飛行管中通過時間為微秒級，在下一組分到來前有充足的時間求得離子的質量數，因此對每一組分可在一次實驗中同時求得淌度和質量數，整個實驗可在1 min內完成。
有時為了獲得更多的離子信息，可在飄移管前和(或)後串聯使用幾種質量分析器，如離子阱或四極濾質器等。
2 離子淌度理論的研究進展
2．1 緩衝氣體對碰撞截面的影響
IMS區分離子是通過與緩衝氣體分子碰撞過程而實現的，緩衝氣體的種類直接影響分離過程。氮氣和氦氣是最常用的兩種氣體，氮氣一般用於常規分析，氦氣常用於結構分析。其他氣體還有二氧化碳、六氟化硫、氨 和四氟化碳 。使用不同緩衝氣體的理論研究在1975年之後便很少，即使是現在也還沒有引起人們足夠的重視，但在實際套用中，使用不同的氣體對獲得良好的解析度和檢測靈敏度相當重要。
離子的碰撞截面不僅與緩衝氣體的質量數有關，而且取決於緩衝氣體極化率的大小 。Matz等 研究6種苯丙胺(安非他明)衍生物在氦氣、氬氣、氮氣與二氧化碳4種不同緩衝氣體下的碰撞截面，結果顯示碰撞截面隨緩衝氣體質量數的上升而上升，但並無嚴格的線性關係。而極化率與碰撞截面之間有良好的線性關係，碰撞截面隨極化率的上升而上升，這也說明碰撞截面更依賴於緩衝氣體的極化率而不是質量數。Els等 研究了不同濃度的氮氣／二氧化碳混合氣體作為緩衝氣體在l0 水平分離5種氯代和溴代乙酸的情況，使用100％ 氮氣，2種組分淹沒在其他峰中，若在緩衝氣體中加入3％二氧化碳，則能達到完全分離，表明載氣的組成明顯影響峰形的檢出。
2．2 離子淌度與質荷比的關係
IMS解析度較低，即使是高分辨IMS也只能達到與常規HPLC相同或稍高的分辨能力，這使其單獨分離複雜混合物變得困難。在IMS發明之初，研究者就試圖通過建立 與m／z的關係，由 推知離子的質量數。但大量實驗數據表明， 與m／z之間只是一種粗略的線性趨勢，遠遠不能滿足人們對離子質量數的精確要求，IMS在質荷比(m／z)
IMMS中只能作為一種前質量分析器。儘管有的物質能夠通過單一的離子淌度技術快速鑑別開來，但IMMS能夠提供的二維“淌度／質量”模式能夠達到對複雜混合物的高分辨分離。在二維IMMS(2-D IMMS)中，不同電荷的離子其“淌度／質量”線性趨勢明顯不同，通過對複雜產物的2-D數據進行分析，找出其不同的“淌度／質量”關係已經成為鑑定和解釋這些產物的一種重要技術。Clemmer等已經通過 與m／z趨勢關係鑑別了低淌度(單電荷)和高淌度(雙電荷)的兩組肽混合物 J。Russel等使用內標作為參照標準，根據 與m／z關係將蛋白質酶解後的肽混合物分開 。Stciner 利用ESI—API—IM—TOF—MS分析水溶性化學戰劑降解產物，使用相同系列的n一烷基胺作為基線標準，利用不同降解產物的與m／z趨勢使其得到鑑定。
離子淌度的測定受各種因素的影響，如電噴霧溶劑組成、飄移區溫度、噴霧電壓、溶劑流速、緩衝氣體流速、冷卻氣體流速等諸多因素影響。
2．3 離子電荷、取代基與碰撞截面的關係
儘管還沒有方法證明氣相離子和溶液中離子的結構之間有如何緊密的關係，但精確測量離子的碰撞截面還是能提高對肽、蛋白質等複雜物質結構的理解。離子中原子間氫鍵和范德華力使其呈現摺疊和緊湊狀態，電荷和庫侖斥力則克服離子內的相互吸引而使分子呈現鬆散狀態。Kindy等利用同位素標記研究了3種蛋白質的酶解產物，發現單乙醯化肽段的碰撞截面比未乙醯化的要高出25％ ～35％ ；雙乙醯化的增加更多，這種增加(特別對大的肽段)遠遠大於乙醯基的體積增大因素，表明乙醯基具有對肽離子整體結構改變的特殊作用。Badman等 叫研究了泛素從ESI進入IM管過程中碰撞截面的變化過程，認為離子進入飄移管的初期均為緊湊結構，受加速電壓的作用才快速伸展成開放結構。
離子中電荷的位置和數量是影響氣相離子碰撞截面的重要參數。Wu等 研究了強啡肽A的3個片段F7(Tyr—Gly—Gly—PHE—Leu—Arg—Arg)、F8(Tyr—Gly—Gly—Phe—Leu—Arg—Arg一Ⅱe)、F、9(Tyr—Gly—Gly—Phe—Leu—Arg—Arg—He—Arg)帶1—3個電荷時的碰撞截面變化情況，結果見表1。單電荷和雙電荷的碰撞截面從F7至F、9增加值穩定在約9％ ，這可用在C端增加一個胺基酸的“大小效果”很好地解釋。另外，所有3種肽從單電荷到雙電荷碰撞截面的增加都保持在相似的7％ 一8％水平。隨著電荷的增加，庫侖斥力增加使肽呈現更鬆散狀態。然而，在F7和F8中引入第3個電荷，卻使碰撞截面急劇上升，這是因為在這些肽中只存在3個鹼性位點，相鄰的兩個精氨酸殘基必須同時質子化，急劇增加的庫侖斥力能使得離子以一種更加伸展的狀態存在，而使碰撞截面急劇增加。F、9離子增加不顯著是因為末端精氨酸殘基的存在可以避免兩個相鄰胺基酸均被質子化。Badman等 總結了1996—2001年間發表的細胞色素e氣態離子碰撞截面的數據，所帶電荷從+3至+20，雖然同電荷離子的碰撞截面數值稍有不同，但均表現為隨電荷的增加而增加，增加幅度也極為相似。
利用碰撞截面最具優越性的地方在於區別具有相同電荷、相似質量的不同離子或質量數相同的異構體離子。Hen．derson等 研究了細胞色素c兩個酶解碎片IFVQK．CAQCHTVEK(相對分子質量為1 633．820)和heme．CAQCHTVEK(相對分子質量為1 633．615)，二者具有極為相似的質量數，在序列已知的情況下，利用軟體模擬其電荷分布情況，分別計算其所需的碰撞截面和加速電壓，測量其離子淌度，求出碰撞截面並與計算值相比較，從而區分兩種碎片，結果顯示兩個碎片均帶兩個電荷，分別為I rVQK—CAQCHTVEK 和heme—C“AQCHTVEK (上標為質子化位置)。
文獻[35]列出了34種常見蛋白質酶解後的660種肽離子的碰撞截面數據，並從統計學角度在理論上分析了胺基酸殘基的內在形狀參數與碰撞截面的關係，從而可通過胺基酸序列預測肽離子的碰撞截面。文獻[36]也有類似報導。
3 展望
質譜技術是當今分析化學領域最重要的技術之一。離子淌度質譜結合了離子淌度技術靈敏、快速、能夠提供離子結構信息和質譜能夠提供準確質量信息的特點，在化合物異構體分析、生物大分子相互作用分析等方面正顯示出越來越多的優越性。目前國內有關離子淌度質譜的報導很少，國外也僅有為數不多的科研機構進行離子淌度質譜的研究。目前離子淌度質譜儀還沒有上市，還有一些需要解決的問題，但經過30多年的發展，其理論研究已近成熟，儀器已配備了MALDI和ESI等新型離子源，有些還同時串聯了四極桿質譜和(或)離子阱質譜，具有更低的檢測限和更高的靈敏度和解析度。可以相信，在不久的將來，離子淌度質譜會成為功能基因組、蛋白質組學研究，以及藥學、醫學和化工等領域不可缺少的重要工具。