構建方法
目前，中藥指紋圖譜技術已涉及眾多方法，包括薄層掃描（TLCS）、高效液相色譜法（HPLC）、氣相色譜法（GC）和高效毛細管電泳法（HPCE）等色譜法以及紫外光譜法（UV）、紅外光譜法（IR）、質譜法（MS）、核磁共振法（NMR）和X—射線衍射法等光譜法。其中色譜方法為主流方法，尤其是HPLC、TLCS和GC已成為公認的三種常規分析手段。由於HPLC具有分離效能高、選擇性高、檢測靈敏度高、分析速度快、套用範圍廣等特點；中藥成分絕大多數可在高效液相色譜儀上進行分析檢測，且積累較豐富的套用經驗。因此高效液相色譜法已成為中藥指紋圖譜技術的首選方法。隨著HPLC— MS和GC—MS等聯用技術的套用，中藥指紋圖譜技術更趨完善。
1 薄層色譜法（TLC） 薄層色譜具有選用範圍廣,重現性好等優點，常用於中藥各種成分的鑑別。用固定波長對薄層展開的各斑點作薄層掃描圖譜比目測的層析圖譜更為客觀準確，因而具有更好的指紋鑑別意義。但由於受薄層板的質量和開放式層析系統等外界因素的影響，易引起一定的實驗誤差。
2 氣相色譜法 (GC) 氣相色譜是封閉性色譜，受外界影響較少，具有高性能、高選擇性、高靈敏度等優點，適合於藥材及製劑中揮發性成分指紋圖譜的研究。一般使用質量型檢測器-氫火焰離子化檢測器（FID）。錢浩泉等用氣相色譜法建立了高良姜及其邊緣植物揮髮油成分的指紋圖譜。具體套用中多與質譜聯用，不僅具有 GC 的高分離效能，而且兼備了質譜鑑定的高靈敏度和準確性。
五味子水煎物指紋圖譜共有指紋峰相對峰面積3 高效液相色譜法 (HPLC) 高效液相色譜具有分離效率高，分析速度快，定量精密度高，檢測器種類多，穩定性好等特點。不受樣品揮發度和熱穩定性的限制，比氣相色譜法套用範圍更廣，樣品中大多數成分均可在高效液相色譜儀上進行分析檢測，是構建指紋圖譜的主要方法之一。由於中藥成分的複雜性，構建指紋圖譜一般採用梯度洗脫，因為逐步提高流動相洗脫能力可獲得較多色譜峰，提供更多指紋信息。在考察條件時，要對指標成分和非指標成分都予以考慮，由於藥材中各種成分的吸收波長及對不同檢測器的回響不同，在構建指紋圖譜時也需要加以考慮。實際套用中多使用多種聯用技術，
充分利用各檢測器的互補性，從不同角度反映藥材及製劑的全貌，從各種圖譜中得到結構信息。
4 高速逆流色譜法 (HSCCC) 它是目前國際上較新型的液－液分配色譜技術，利用相對移動的兩種互不相溶溶劑，在處於動態平衡的兩相中將具有不同分配比的組分分離。已有報導將 HSCCC套用於生物鹼、黃酮、木脂素、蒽醌等天然產物的分離分析。具有分離效率高，溶劑用量少，無吸附，樣品回收率高,重現性好和適用範圍廣等優點。
5 高效毛細管電泳法 (HPCE) 高效毛細管電泳技術是以高壓電場為驅動，毛細管為分離通道，依據樣品中各組分淌度和分配行為上的差異而實現高效快速分離的新型電泳技術。毛細管電泳的廣泛套用取決於其多變的分離模式，幾乎涉及分析化學中所有的分離對象，小到無機離子，大到蛋白質和高分子聚合物，也能夠分析不帶電荷的中性物質。具有所需樣品少、溶劑消耗少、抗污染能力強、可直接分析水溶液等優點。其中毛細管區帶電泳 (CZE) 和膠束電動毛細管電泳色譜 (MECC) 是中草藥分析中最常見的兩種模式。但該方法的重現性有待提高。
6 紫外可見光譜 (UV) 紫外可見光譜反映不同化學物質的電子共扼體系特徵，具有加和性，對於混合物的鑑別專屬性差，解析度低，故紫外光譜很少用於指紋圖譜的構建。
7 紅外光譜和近紅外光譜 (IR) 紅外光譜是由分子的振動－轉動能級躍遷產生的光譜，紅外光譜具有高度的特徵性。近紅外光譜法在中藥質量控制方面有較好的套用前景。
8 核磁共振法 (NMR) 從純有機化合物的核磁共振氫譜上可獲得結構信息，包括各類質子的化學位移、數量核偶合關係。核磁共振譜具有高度的重現性和特徵性，易於解析和進一步研究，可評價藥材和中成藥質量的均一性和穩定性。
9 質譜法 (MS) 將中藥提取液置質譜儀中進行電子轟擊電離，可獲得提取液中化學成分的質譜指紋譜，不同中藥提取液所含成分不同，所得質譜圖顯示的分子離子峰及進一步，裂解碎片峰不一致，可供鑑別。
10 X射線衍射法 物質被X射線照射可產生不同程度的衍射現象，只要某一混合物的組成是恆定的，其衍射圖譜可以作為該混合物的特徵圖譜。該法具有圖譜指紋專屬性強，信息量大,所需樣品量小等諸多優點，X射線衍射法在動物類藥材鑑定與辨別中有獨特的優勢。
11 分子生物學法 (DNA) 利用聚合酶鏈反應從不同生物樣品中人工合成 DNA片斷，而這種 DNA片斷的大小、數目可因不同的生物而異，故稱之為 DNA指紋圖譜。該技術具有重複性好、靈敏度高的優點。限制性內切酶片段長度多態性（RFLP）是最常用的構建 DNA指紋圖譜的方法，但該法費時費力，套用受到限制。隨機擴增多態 DNA（RAPD）標記，可以在特異 DNA序列尚不清楚的情況下，檢測DNA的多態性，這是構建中藥指紋圖譜的新方法，具有極好的套用前景。 羅志勇等採用 RFLP技術,分析了人參、西洋參基因 DNA指紋圖譜。
分析、技術
隨著分離分析技術的發展，中藥質量研究也由過去“四大鑑別”(基元鑑別、性狀鑑別、顯微鑑別、理化鑑別)發展到反映中藥材全貌的指紋體系，即反映中藥材的多元化學組成特性的化學指紋圖譜和反映生物體 (除礦物、樹脂類外) 特性的基因指紋圖譜，從有效成分和遺傳物質兩方面實現對中藥材的質量控制，為中藥材以及中成藥提供綜合的和可量化的質量評價方法。
化學指紋圖譜
正在進行中藥指紋圖譜研究中國中藥指紋圖譜的研究已有相當的基礎，最早可以追溯到20世紀60
年代，如採用薄層色譜、紫外光譜、紅外光譜法來描述中藥材主要成分的特徵，這是早期的原始的指紋圖譜，具有直觀、在簡單情況下容易比較差異的優點。隨著分析技術的飛速發展和微電腦的廣泛套用，基於化學計量法的中藥指紋圖譜的研究方法向高效、靈敏、專屬、智慧型化、聯用型的方向發展，高效液相、高效毛細管電泳、高速逆流色譜、核磁共振、近紅外光譜等新興分析技術的套用和各種數學分析方法的運用，為中藥指紋圖譜的研究與發展提供了廣闊的前景。
紫外光譜指紋圖譜
紫外光譜法是1995年以前指紋圖譜常用的方法。由於不同中藥所含的不飽和程度有差異，因而導致其紫外吸收曲線的形態、峰位、峰強度亦有差異，以此達到鑑別效果。常用導數光譜及結合各種數學分析法來消除樣品中的一些無關吸收，排除原圖譜中的某些干擾。
紅外光譜又稱分子振動轉動光譜，是一種分子吸收光譜。當樣品受到頻率連續變化的紅外光照射時，分子吸收了某些頻率的輻射，並由其振動或轉動運動引起偶極矩的淨變化，產生分子振動和轉動能級從基態到激發態的躍遷，使相應於這些吸收區域的透射光強度減弱。記錄紅外光的百分透射與波數或波長關係的曲線，就得到紅外光譜。一般的紅外光譜是對整個化合物分子的鑑別，比單純的官能團的化學定性鑑別專一性更強。而中藥材的紅外光譜在本質上與純化合物紅外光譜不同，它是混合物中各個組分紅外光譜的疊加。中藥材各種化學成分只要在質和量的方面相對穩定，並且樣品處理方法按同一要求進行，則其紅外光譜也是應該相對穩定的。因此這樣得到的混合物紅外光譜應該是具有一定的客觀性和可重複性。利用上述原理，不同混合物的紅外光譜各主要吸收峰歸屬，只要在4000-400cm，範圍內比較光譜差異即可。這種差異可以表現在三個方面：一是在某一波數處鑑別雙方只有一方有明顯差異；二是在某一波數內，鑑別雙方的光譜中，吸收峰的形狀和強度都有明顯差異；三是“指紋區”，面貌不同。
近紅外光譜法(NIRS)是一種用於鑑定有機物質十分有用的技術，是中紅外光譜中C-H， N-H，O-H和S-H的共振吸收，具有高信息量。波長範圍為780nm-2500nm，而且該光譜取決於粒子大小、多晶型、殘留溶劑、濕度等等因素。因此待測物光譜的鑑定不可能直接與參比物質光譜比較後確定，需要通過一系列樣本的檢測(必須預先知道樣本中相關成分的含量或樣本的定性歸屬)，運用化學計算學手段，建立樣本與信息之間的數學模型。運用該模型即可以對未知樣本(例如新近購進的原藥材或新生產的成品等)進行辨別分析(給出結果：合格與否、含量多少等)。該方法為非破壞性方法，可實現產品的無損檢測，具有檢測速度快，操作簡單，所需樣品少，適宜於液體、固體、粘稠流體的分析及過程控制等優點。但是在進行定性定量分析中必須採用一定的數據處理，需要掌握一定的化學計量知識。
螢光光譜
中藥注射劑常含螢光性物質，但因不同注射劑所含具體螢光性物質不同，同種注射劑又因廠家的具體配方的差異或製備工藝條件的波動，均會使其特徵的螢光激發、發射光譜不同或其強度呈現差異；根據注射劑的螢光圖譜的差異達到快速鑑別、認定和控制配方、工藝的目的。
螢光光譜不像紅外光譜那樣具有明顯的指紋特徵，但具有高靈敏度的顯著優勢，且差異更為一目了然，易於判斷，因此，可以作為紅外光譜指紋技術的一種補充，用於中藥注射液的鑑別和認定，以及生產工藝的控制和成藥熱穩定性研究等。
色譜指紋圖譜
色譜指紋圖譜最實用、套用也是最廣泛。中藥色譜指紋圖譜是一種綜合的、可量化的鑑別手段，是當前符合中藥特色的評價中藥真實性、穩定性和一致性的質量控制模式之一。色譜指紋圖譜最大的優點是具有分離的功能。
中藥TLC為傳統的定性、半定量分析方法，在中國“七五”、"十一五”及“
九五”公關課題中有大量採用薄層色譜法進行地道藥材的定性鑑別。該法操作簡單、分析速度快速、一次分析樣品多，提供信息量大，用固定波長對薄層展開的各個斑點進行掃描，所得掃描圖譜比目測的層析圖譜更加客觀準確，因此具有較好的指紋鑑別意義。其最大的缺點是重現性以及精密度差，所以在指紋圖譜套用中受到限制，但可以作為中藥指紋圖譜研究的借鑑和補充。
氣相色譜(GC)指紋圖譜
中藥指紋圖譜技術
GC最適合於各種主含易揮發性成分藥材及其製劑的分析，尤其是毛細管氣相色譜法，解析度很高，往往一個色譜可以分出百個成分。該法靈敏度高、分離度好，分析速度快，但是分析範圍只是局限於低沸點成分，是指紋圖譜研究的主要方法之一。
HPLC適用於成分複雜而不易分離的分析對象，具有分離效能高，靈敏度高，分析速度快，不需要氣化，檢測手段多等優點，是目前指紋圖譜技術中用途最廣泛的一種方法。
HSCCC是當前國際流行的新型的液-液分配技術。套用動態液一液分配原理，利用相對移動互不混溶的兩相溶劑，在處於動態平衡的兩相中將具有不同分配比的樣品組分離。其特點是不用固相載體作固定相，克服了樣品吸附、損失、峰形拖尾問題。操作更為簡便，容易掌握。對樣品的預處理要求低，僅需一般粗提物即可。該技術的回收率高，能實現梯度操作，亦能重複進樣，在中藥質量分析控制研究中，尤其在指紋圖譜研究中有較好的套用前景。
毛細管電泳(CE)又叫高效毛細管電泳(HPCE)，以彈性石英毛細管為分離通道，以高壓直流電場為驅動力，依據樣品中各組分之間淌度和分配行為的差異而實現分離的電泳分離分析方法，是近年發展起來的一種新的分離技術，是電泳技術和層析技術結合的產物，兼有高壓電泳的高速高解析度及HPLC的高效率等特點，其選擇性與高效液相有很大的互補性。因此在指紋圖譜研究方面的套用越來越廣泛。
聯用技術 由於中藥複方製劑成分複雜，現行的各種單一測定方法給出信息少均無法建立較完善的指紋圖譜，因而有人提出建立多維指紋譜嘗試解決這一問題。所謂多維，即採用多種分析儀器聯用的模式來測定指紋圖譜，各譜圖間相互補充信息，可對複雜供識品有更清晰完整的認識。目前最常用的是高效液相（或氣相色譜）/二極體陣列檢測器/質譜/質譜聯用方式 (HPLC或GC/ DAD/ MS/ MS) 所得的多維指紋圖譜。多維譜的建立既能較系統、較完整地解決中藥複方製劑質量控制的難題，又為中藥研究中缺乏標準品的難題提供了種新的解決途徑。除了手性化合物外，從機率上要找出4個或以上圖譜信息完全相同的化合物幾乎是不可能的。
X射線衍射法
當某一物質進行衍射分析時，該物質被X射線照射而產生不同程度的衍射現象。可分為單晶X衍射法與粉末X衍射法。物質組成、晶型、分子內成鍵方式、分子的構型等決定該物質產生特有的衍射圖譜。如果該物質是一混合物，X-射線衍射圖是各混合物各組分衍射效應的疊加。只要這一混合物的物質組成是恆定的，其衍射圖譜可以作為該混合物的特徵圖譜。X -衍射指紋圖譜具有指紋性強，圖譜穩定可靠等特點。尤其是X衍射Fourier譜分析法可用於動物類藥材的鑑定與偽品識別。
核磁共振(NMR)指紋圖譜
中藥指紋圖譜的相關會議核磁共振氫譜(1H-NMR)是鑑定有機化合物結構的重要的方法之一。它
可以獲得化合物的包括各類質子的化學位移、數量、偶合關係等多個結構信息。如可以用一定程式獲取植物類中藥的特徵性化學成分(或化學成分組)的總提取物，同時這些特徵的化學成分的含量是相對固定的，則在規範的提取分離條件下，植物類中藥的1H-NMR圖譜與植物品種存在著嚴格的對應關係，沒有混淆的可能性。圖譜中的信號強弱反映了混合物中各組分的相對含量。在對特徵總提物進一步分離得到單體後，通過結構鑑定和NMR研究，可以對指紋圖譜中的各特徵譜線進行歸屬。
分子生物指紋圖譜
隨著分子生物學技術的迅速發展，DNA分子技術己越來越多的用於中藥材品種鑑別的研究。分子生物指紋圖譜是指採用分子標記技術得到的某一中藥材品種的DNA指紋圖譜。如對於人參、西洋參一類中藥材的鑑別，用傳統的方法(性狀、顯微、理化等鑑別方法)都顯片面性，結果往往很模糊，因而其產地、生長年限、加工方式等因素與其性狀和成分不呈很強的相關性，但套用分子生物學技術可以迎韌而解。
