配位體的性質
作為配位體,應滿足以下幾個條件:
①它所形成的配合物應能溶於水,即要以離子形式存在於溶液中;
②配位體不干擾陽極和陰極的氧化一還原反應,在溶液中不分解和水解;
③所形成的配離子要有一定的穩定性和超電壓。
配位體的種類很多,主要分為無機和有機兩大類。無機配體的數量比較少,結構也比較簡單。有機配體的數量繁多,結構複雜。雖然其配位能力可以從配位原子的性質來推斷,但是,它的結構因素往往也起重大作用,如共軛兀鍵的作用,螯合作用,空間位阻以及取代基的影響等。
配位體的類型
1.生物特效配位體
許多生物大分子或小分子都可作為生物特效配位體,如:
①核鹼、核苷、核苷酸、寡聚核苷酸、核糖核酸(RNA)、脫氧核糖核酸(DNA);
②胺基酸、多肽、蛋白質、酶;
③輔酶,即由維生素PP(煙酸和煙酸胺)或B族維生素與核苷酸、金屬離子組成,如輔酶I [Co I,又稱煙醯胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)];
④外源凝集素(可從扁豆、小麥胚、蓖麻中提取);
⑤糖類[包括單糖、寡糖、多糖(如肝素)];
⑥抗原和抗體;
⑦親和素-生物素;
⑧激素;
⑨生物細胞、生物分子組合體和微生物。
上述配位體都具有特效的生物親和識別功能,可與互補的生物分子偶合成鎖匙絡合物。
2.染料配位體
利用一些合成染料分子具有與核苷酸相似的化學結構,作為生物模擬配位體。現已獲得廣泛套用的為蒽醌活性三嗪染料,如汽巴藍F3G-A,萘活性三嗪染料,如布洛欣紅HE-3B以及氟代均三嗪染料汽巴黃F3R等,此類配位體價廉易得,已用於製備型親和色譜。
3.定位金屬離子配位體
許多有機螯合劑,如亞氨基二乙酸(IDA)、亞乙基二胺四乙酸、咪唑、硫脲、8-羥基喹啉、雙硫腙等,都可與金屬離子,如Cu 、Zn 、Ni 、Mg 、Fe 等生成穩定的螯合物,這些螯合物呈現出對蛋白質、酶的特效親和性,從而在親和色譜中也獲得越來越多的套用。
4.包合配合物配位體
以β-環糊精(β-CD)為主體,利用它具有的特殊空穴結構,與客體生物分子形成主一客體包合配合物。此外冠醚、穴醚、杯芳烴也可作為模擬酶,與生物分子形成包合配合物,它們都已用於親和色譜的分離和分析。
5.電荷轉移配位體
電荷轉移配位體可以是電子給予體,如5,10,15,20-四(對羥基苯基)卟啉,或電子接受體,如磺醯化酞菁銅,利用它們與互補生物分子問的正、負電荷吸引力的親和作用,而實現對生物分子的分離。
6.共價配位體
利用具有二硫橋鍵(-S-S-)的吡啶二硫化物與小肽(谷胱甘肽)偶聯作為配位體,可用於分離含硫蛋白質,這是一種特殊的生物選擇性親和作用。
配位體的鍵合
對含有多個活性作用位的配位體,它與偶聯間隔臂載體的鍵合,可能有幾種不同的連線方式來生成親和固定相,這會直接影響配位體周圍的立體環境,並進而會產生對同一種配位體,因與載體連線方式的差異,對生物大分子呈現截然不同的選擇性。
如一磷酸腺苷AMP和二磷酸腺苷ADP與偶聯氨己基或己醯肼的瓊脂糖製備的親和固定相,可有四種連線方式,如圖所示。圖中(a)N-(6-氨己基)-AMP-瓊脂糖[N-AMP],(b)C-(6-氨己基)-AMP-瓊脂糖[C-AMP],(c)P-(6-氨己基)-P-(5'-腺苷)-焦磷酸-瓊脂糖[P-ADP],(d)核糖基連線的AMP[R-AMP]。
由上述實例可看到,當選用的配位體有幾個可與間隔臂偶聯的活性作用點,並且生物大分子與配位體的結合方式並不清楚的情況下,最好合成幾種親和固定相,以便評價它們與生物大分子的親和結合的效能。對有兩個或多個連線作用點的配位體,應選擇對化學衍生相對敏感的作用點。如對上述AMP衍生物,由於8位(C)取代配位體的製備程式相對簡便並節省原料,而6位N(N)或磷酸(P)取代衍生物的合成路線複雜,並需專門的有機合成訓練,因而從製備可行性考慮,多採用8位取代的方案。一般認為配位體分子愈大,它與互補生物大分子的活性作用點越多,製備親和固定相可選用的合成路線自由度也越大。
配位體的套用
親合色譜中的吸附/解附
親合色譜吸附的基礎是生物特異性吸附,或者是蛋白質與具有一定結構的配位體反應。吸附作用不是一般的色譜作用,它是在低鹽或高鹽寬的pH範圍內進行吸附。配位密度對保留特性和柱容量的影響不同於其它色譜運行機理,解附的完成是依靠加入在流動相中的配位體、改變pH範圍、變化離子強度來完成的。特異性置換劑是親合色譜中比較理想的解附劑。它能解附配位體和生物大分子之間的結合點。一般在解附過程中,蛋白質由於結構受到破壞,而使回收率降低。
免疫親合色譜,由於它能在分離純化過程中使生物活性物質保持不變,因此,得到廣泛的套用。特別是用單克隆抗體作為配位體的套用更廣。免疫親合色譜在工業上純化干擾素等方面取得了比較滿意的結果。