製備方法
轉基因小鼠的製備技術主要有兩類，DNA原核顯微注射法和胚胎幹細胞囊胚顯微注射法。
DNA原核顯微注射法
通過顯微操作儀將外源基因直接注入受精卵，使外源基因整合到DNA中，發育成轉基因動物。此方法是最經典的轉基因動物製作方法，也是套用最廣泛的方法，轉基因動物研究大都是在Palmiter等方法的基礎上有所改進而進行的。由這種方法製備的動物品種屬於狹義的轉基因動物的範疇。
轉基因小鼠由這種方法製備的轉基因小鼠其插入目的基因的形式通常是多拷貝首尾相連的形式，其整合到基因組的具體機制並沒有完全研究清楚。
胚胎幹細胞囊胚顯微注射法
在體外將外源基因導入胚胎幹細胞，然後將轉基因的胚胎幹細胞通過顯微操作儀注入動物囊胚，此胚胎幹細胞可參與宿主的胚胎構成，形成嵌合體，直至達到種系嵌合。胚胎幹細胞體外培養時保持未分化狀態，當被注入囊胚腔後，可以參與包括生殖腺在內的各種組織嵌合體的形成，因此將外源DNA導入胚胎幹細胞就可實現基因的轉移。出生的動物其生殖系統就可能整合上外源基因，通過雜交繁育可得到具有純合目的基因的個體，即轉基因動物。胚胎幹細胞介導法在小鼠上套用比較成熟，在大動物上套用較晚。基因的敲除及捕獲常用這類方法。
繁殖篩選
轉基因小鼠的繁育及其純合子的篩選
自轉基因小鼠問世以來，就涉及到轉基因小鼠的繁育及其純合子的篩選問題，尤其對供商業化套用的小鼠模型更為重要。相對於非轉基因動物而言，轉基因動物具有獨特的遺傳特性：轉基因是已知的外源基因；它隨機地整合在小鼠染色體上；轉基因的整合大部分為單位點，少數為多位點整合;整合的拷貝數有單拷貝，也有多拷貝。故套用原代(founder)轉基因動物作為同一祖先繁殖產生的後代均為單系。因此，轉基因小鼠純合子的篩選必須在單系內進行。純合子轉基因小鼠具有以下優點：(1)免除了複雜的、昂貴的檢測；(2)能獲得基因型完全一致的動物個體；(3)有利於動物的保種等。然而在轉基因小鼠純合子篩選過程中常常遇到以下問題：
(1)純合轉基因鼠的篩選是單系傳遞，親緣交配，這就帶來一個很大的矛盾，即轉基因在純合過程中只能在同胞(全同胞或半同胞)之間進行交配，而這種交配方式會使得種系本身近交係數增大；(2)在傳代過程中導入的外源基因有可能產生變異，導致所需性狀的改變。因此，對轉基因小鼠純合子的選育已在經典的方法基礎上提出多種方法來縮短純合子的育種過程，其中如聚合酶鏈反應(PCR)法；Southern雜交法；螢光原位雜交法(fluorescenceinsitehybridization,FISH)及表型觀察法等。
