載體構建

載體構建(vectorconstruction)，為把DNA分子運送到受體細胞中去，必須尋找一種能進入細胞、在裝載了外來的DNA片段後仍能照樣複製的運載體。理想的運載體是質粒(plasmid)，在基因工程中，常用人工構建的質粒作為載體。載體構建即是構建含外源DNA的質粒。

簡介

pYrbio-Mir30-shRNA質粒圖譜

當給質粒插入一段外源DNA片段後，它依然能夠進行自我複製。

人工構建

人工構建的質粒可以集多種有用的特徵於一體，如含多種單一酶切位點、抗生素耐藥性等。常用的人工質粒運載體有pBR322、pSC101。pBR322含有抗四環素基因(Tcr)和抗氨苄青黴素基因(Apr)，並含有5種內切酶的單一切點。如果將DNA片段插入EcoRI切點，不會影響兩個抗生素基因的表達。但是如果將DNA片段插入到Hind Ⅲ、BamH Ⅰ 或 SalⅠ切點，就會使抗四環素基因失活。這時，含有DNA插入片段的pBR322將使宿主細菌抗氨苄青黴素，但對四環素敏感。沒有DNA插入片段的pBR322會使宿主細菌既抗氨苄青黴素又抗四環素，而沒有pBR322質粒的細菌將對氨苄青黴素和四環素都敏感。pSC101與pBR322相似，只是沒有抗氨苄青黴素基因和PstI切點。質粒運載體的最大插入片段約為10 kb(kb表示為千鹼基對)。

載體構建

載體構建是分子生物學研究常用的手段之一。主要包括已有載體多克隆位點MCS的改造和已有載體啟動子、增強子、篩選標記等功能元件的改造。載體構建完成後可利用PCR原理進行測序驗證。