蒽酮比色法測糖試驗
一實驗目的掌握蒽酮比色法測糖的原理和方法
二實驗原理蒽酮可以與游離的已糖或多糖中的已糖基、戊糖 基及已糖醛酸起反應，反應後溶液呈藍綠色，在620nm處有最大吸收。
三實驗器材及試劑
馬鈴薯乾粉
可調試移液器或移液管
可見分光光度計（723型）
電子分析天平
水浴鍋
電爐子
蒽酮試劑：取2g蒽酮溶解到80%H2SO4中，以80%H2SO4定容到1000ml，當日配製使用。
標準葡萄糖溶液（0.1mg/ml）：100mg葡萄糖溶解到蒸餾水中，定容到1000ml備用。
四、操作
1.製作標準曲線
取7支幹燥潔淨的試管，按表1順序加入試劑，進行測定。
以吸光度值為縱坐標，各標準溶液濃度（mg/ml ）為橫坐標作圖得標準曲線。
表1 蒽酮比色法定糖——標準曲線的製作
沸水浴中準確煮沸10min，取出用流水冷卻，室溫放10min,於620nm處比色
葡萄糖濃度（mg/ml）
2.樣品含量的測定
樣品液的製作：
精確稱取馬鈴薯乾粉0.1g置於錐形瓶中—→加入30ml沸水—→沸水浴30min（不時搖動）—→取出，
3000rpm離心10min（或過濾）—→反覆洗滌殘渣2次—→合併濾液—→冷卻至室溫—→定容到50ml的錐形瓶中—→再從中取出1ml，再定容到10ml的容量瓶中
樣品液的測定：
（1）取4支試管，按照表2加樣（加蒽酮時需要冰水浴5min冷卻）
表2 蒽酮比色法定糖——樣品的測定
（2）加樣冷卻完成後置沸水中煮沸10min，取出流水冷卻放置10min，620nm處比色測量各管OD值。
（3）以1號試管作為調零管，2、3、4號管的OD值取平均後從標準曲線上查出樣品液相應的含糖量。
3．結果計算：
C×V
w = ————×100%
m，
式中w：糖的質量分數（%）
C：從標準曲線中查出的糖質量分數（mg/ml）
V：樣品稀釋後的體積（ml）
m：樣品的質量（ml）
原理
植物在個體發育的各個時期，代謝活動也發生相應的變化，碳水化合物的代謝也不例外，其含量也隨之發生變化。了解可溶性糖含量的變化，在生理上和實踐上都有重要的意義。這裡介紹的是蒽酮比色法，糖在硫酸的作用下生成糖醛，糖醛再與蒽酮作用，形成一種綠色的絡合物，顏色的深淺與糖含量有關。方法簡便，但沒有志一性，對於絕大部分的碳水化合物都能與蒽酮反應，產生顏色。
儀器藥品
721型分光光度計 分析天平
研缽 恆溫水浴鍋
燒杯 容量瓶
三角燒瓶 大試管
移液管 漏斗
乙醚 草酸鈉
飽和醋酸鉛
葡萄糖標準溶液：稱取已在80℃烘箱中烘至恆重的葡萄糖100mg，配製成500ml溶液，即得每ml含糖為200μg的標準溶液。
蒽酮試劑：稱取1g經過純化的蒽酮，溶解於1000ml稀硫酸中即得。硫酸溶液由760ml濃硫酸（比重1.84)稀釋成1000ml而成。
操作步驟
1．可溶性糖的提取
稱取重約5g的新鮮植物葉子，於研缽中乙醚少許，仔細研磨成均勻的漿狀物，倒入燒杯中，用70℃熱水洗滌研缽，洗液併入燒杯中，再加蒸鎦水30─40ml。將燒杯放在水浴鍋中加熱，保持溫度70─80℃約半小時，冷卻後1滴1滴地加入飽和中性醋酸鉛，以除去蛋白質，直至加入醋酸鉛時不再形成白色沉澱為止。然後將此混合物連同殘渣一併洗入100ml容量瓶中，加水至刻度，充分振盪。以乾燥漏斗將濾液過濾於一乾燥的三角燒瓶中，瓶中事先放有少量（約0.2─0.4g）草酸鈉粉末，以除去濾液中過量的醋酸鉛，使生成草酸鉛沉澱，再行過濾，所得的透明濾液即為可溶性糖提取液。
2．顯色及比色
吸取上述糖提取液1ml，放入一乾潔的試管中，加蒽酮試劑5ml混合之，於沸水浴中煮沸10分鐘，取出冷卻，然後於分光光度計上進行測定，波長為625nm，測得吸光度。從標準曲線上查得濾液中的糖含量（或經直線回歸公式計算），然後再行計算樣品中含糖百分數。
3．繪製標準曲線
取標準葡萄糖溶液將其釋成一系列不同濃度的溶液，濃度分別為每ml含糖0、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100μg。按上述方法分別測得其吸光度，然後繪製A026－糖濃度曲線，或進行直線回歸求得直線方程。
4．計算樣品中含糖百分數(% )
設V為植物樣品稀釋後的體積(ml)
C為提取液的含糖量(μg/ml)
W為植物組織鮮重(g)
則得計算式如下： %=C×V/（W×1000000）×100%
蒽酮比色法測定多糖含量
[a]多糖含有幾百個或更多殘基，但只有一個還原基團，因此它的還原能力極弱，對於他們的測定，應先將它們用酸水解成單糖組分。
蒽酮比色法是一種快速而簡便的定糖方法，糖類遇濃硫酸脫水生成糠醛及其衍生物，該衍生物與蒽酮發生反應，反應後溶液呈藍綠色，於620nm處有最大吸收。因此可用此方法測定多糖含量。
[b]試劑
2g/L蒽酮試劑：溶解2g蒽酮於1L濃硫酸（98%的濃硫酸）中，當日配製使用。
0.01g/L葡萄糖溶液（可加幾滴甲苯作防腐劑）
0.1g/L糖元溶液
[c]實驗器材
試管及試管架 吸量管（1ml，5ml) 恆溫水浴箱（100℃） 製冰機 紫外分光光度計 滴管 白瓷板
製作標準曲線
準確稱取0.1g葡萄糖（分析純），溶解並用蒸餾水定容至100ml後，分別取出1ml,2ml,3ml,4ml,5ml分別加入到50的容量瓶中，並用蒸餾水定容到50ml，配成濃度分別為20ug/ml,40ug/ml,60ug/ml,80ug/ml,100ug/ml,各取1ml於試管中，再加入3ml的蒽酮試劑，迅速浸入冰水中冷卻，待幾支試管均勻加完後，一起浸入100℃恆溫水浴箱中，為防止水分蒸發，應在試管口上加蓋一個玻璃球或者加一個塞子，自溫度重新升至100℃起計時，準確保溫10min後取出，用流動水冷卻，然後，於室溫中平衡片刻（約10min左右），在分光光度計上，波長620nm處，用0.5cm厚度的比色杯，以空白管做對照空白（此處的空白是指不加葡萄糖的蒽酮試劑，其他反應條件都一致），進行比色。
既得標準曲線。
如下表格
| 編號 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| 體積ml | 1（蒸餾水） | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| 濃度ug/ml | 0 | 20 | 40 | 60 | 80 | 100 |
[d]樣品測定
如上述條件一致，但要記得用除去蛋白質的樣品溶液進行測定，否則會影響測定結果。
樣品含糖量計算：
C×V2×D
樣品含糖量（%）=----------------------×100%
W×V1×10
其中C----在標準曲線上查出的糖含量（ug),
V2---提取液總體積（ml）
V1---測定時取用體積（ml）
D-----稀釋倍數
W-----樣品重量（g）
10-----樣品重量單位g換算成ug的倍數
注意事項：
1.一定要注意溫度要控制在100℃
2.從100℃開始準確計時10min,然後迅速冷卻，於室溫中平衡10min.
3.蒽酮要注意避光保存。配置好的蒽酮試劑也應注意避光，當天配製好的當天使用。
4.試管要保證乾燥清潔，無殘留水滴。
