蒽酮比色法

蒽酮比色法是一個快速而簡便的定糖方法。蒽酮可以與游離的已糖或多糖中的已糖基、戊糖基及已糖醛酸起反應,反應後溶液呈藍綠色,在620nm處有最大吸收。本法多用於測定糖原的含量,也可用於測定葡萄糖的含量。蒽酮比色法是一種快速而簡便的定糖方法,糖類遇濃硫酸脫水生成糠醛及其衍生物,該衍生物與蒽酮發生反應,反應後溶液呈藍綠色,於620nm處有最大吸收。準確稱取0.1g葡萄糖(分析純),溶解並用蒸餾水定容至100ml後,分別取出1ml,2ml,3ml,4ml,5ml分別加入到50的容量瓶中,並用蒸餾水定容到50ml,配成濃度分別為20ug/ml,40ug/ml,60ug/ml,80ug/ml,100ug/ml,各取1ml於試管中,再加入3ml的蒽酮試劑,迅速浸入冰水中冷卻,待幾支試管均勻加完後,一起浸入100℃恆溫水浴箱中,為防止水分蒸發,應在試管口上加蓋一個玻璃球或者加一個塞子,自溫度重新升至100℃起計時,準確保溫10min後取出,用流動水冷卻,然後,於室溫中平衡片刻(約10min左右),在分光光度計上,波長620nm處,用0.5cm厚度的比色杯,以空白管做對照空白(此處的空白是指不加葡萄糖的蒽酮試劑,其他反應條件都一致),進行比色。

蒽酮比色法測糖試驗

一實驗目的掌握蒽酮比色法測糖的原理和方法

二實驗原理蒽酮可以與游離的已糖或多糖中的已糖基、戊糖 基及已糖醛酸起反應,反應後溶液呈藍綠色,在620nm處有最大吸收。

三實驗器材及試劑

馬鈴薯乾粉

可調試移液器或移液管

可見分光光度計(723型)

電子分析天平

水浴鍋

電爐子

蒽酮試劑:取2g蒽酮溶解到80%H2SO4中,以80%H2SO4定容到1000ml,當日配製使用。

標準葡萄糖溶液(0.1mg/ml):100mg葡萄糖溶解到蒸餾水中,定容到1000ml備用。

四、操作

1.製作標準曲線

取7支幹燥潔淨的試管,按表1順序加入試劑,進行測定。

以吸光度值為縱坐標,各標準溶液濃度(mg/ml )為橫坐標作圖得標準曲線。

表1 蒽酮比色法定糖——標準曲線的製作

沸水浴中準確煮沸10min,取出用流水冷卻,室溫放10min,於620nm處比色

葡萄糖濃度(mg/ml)

2.樣品含量的測定

樣品液的製作:

精確稱取馬鈴薯乾粉0.1g置於錐形瓶中—→加入30ml沸水—→沸水浴30min(不時搖動)—→取出,

3000rpm離心10min(或過濾)—→反覆洗滌殘渣2次—→合併濾液—→冷卻至室溫—→定容到50ml的錐形瓶中—→再從中取出1ml,再定容到10ml的容量瓶中

樣品液的測定:

(1)取4支試管,按照表2加樣(加蒽酮時需要冰水浴5min冷卻)

表2 蒽酮比色法定糖——樣品的測定

(2)加樣冷卻完成後置沸水中煮沸10min,取出流水冷卻放置10min,620nm處比色測量各管OD值。

(3)以1號試管作為調零管,2、3、4號管的OD值取平均後從標準曲線上查出樣品液相應的含糖量。

3.結果計算:

C×V

w = ————×100%

m,

式中w:糖的質量分數(%)

C:從標準曲線中查出的糖質量分數(mg/ml)

V:樣品稀釋後的體積(ml)

m:樣品的質量(ml)

原理

植物在個體發育的各個時期,代謝活動也發生相應的變化,碳水化合物的代謝也不例外,其含量也隨之發生變化。了解可溶性糖含量的變化,在生理上和實踐上都有重要的意義。這裡介紹的是蒽酮比色法,糖在硫酸的作用下生成糖醛,糖醛再與蒽酮作用,形成一種綠色的絡合物,顏色的深淺與糖含量有關。方法簡便,但沒有志一性,對於絕大部分的碳水化合物都能與蒽酮反應,產生顏色。

儀器藥品

721型分光光度計 分析天平

研缽 恆溫水浴鍋

燒杯 容量瓶

三角燒瓶 大試管

移液管 漏斗

乙醚 草酸鈉

飽和醋酸鉛

葡萄糖標準溶液:稱取已在80℃烘箱中烘至恆重的葡萄糖100mg,配製成500ml溶液,即得每ml含糖為200μg的標準溶液。

蒽酮試劑:稱取1g經過純化的蒽酮,溶解於1000ml稀硫酸中即得。硫酸溶液由760ml濃硫酸(比重1.84)稀釋成1000ml而成。

操作步驟

1.可溶性糖的提取

稱取重約5g的新鮮植物葉子,於研缽中乙醚少許,仔細研磨成均勻的漿狀物,倒入燒杯中,用70℃熱水洗滌研缽,洗液併入燒杯中,再加蒸鎦水30─40ml。將燒杯放在水浴鍋中加熱,保持溫度70─80℃約半小時,冷卻後1滴1滴地加入飽和中性醋酸鉛,以除去蛋白質,直至加入醋酸鉛時不再形成白色沉澱為止。然後將此混合物連同殘渣一併洗入100ml容量瓶中,加水至刻度,充分振盪。以乾燥漏斗將濾液過濾於一乾燥的三角燒瓶中,瓶中事先放有少量(約0.2─0.4g)草酸鈉粉末,以除去濾液中過量的醋酸鉛,使生成草酸鉛沉澱,再行過濾,所得的透明濾液即為可溶性糖提取液。

2.顯色及比色

吸取上述糖提取液1ml,放入一乾潔的試管中,加蒽酮試劑5ml混合之,於沸水浴中煮沸10分鐘,取出冷卻,然後於分光光度計上進行測定,波長為625nm,測得吸光度。從標準曲線上查得濾液中的糖含量(或經直線回歸公式計算),然後再行計算樣品中含糖百分數。

3.繪製標準曲線

取標準葡萄糖溶液將其釋成一系列不同濃度的溶液,濃度分別為每ml含糖0、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100μg。按上述方法分別測得其吸光度,然後繪製A026-糖濃度曲線,或進行直線回歸求得直線方程。

4.計算樣品中含糖百分數(% )

設V為植物樣品稀釋後的體積(ml)

C為提取液的含糖量(μg/ml)

W為植物組織鮮重(g)

則得計算式如下: %=C×V/(W×1000000)×100%

蒽酮比色法測定多糖含量

[a]多糖含有幾百個或更多殘基,但只有一個還原基團,因此它的還原能力極弱,對於他們的測定,應先將它們用酸水解成單糖組分。

蒽酮比色法是一種快速而簡便的定糖方法,糖類遇濃硫酸脫水生成糠醛及其衍生物,該衍生物與蒽酮發生反應,反應後溶液呈藍綠色,於620nm處有最大吸收。因此可用此方法測定多糖含量。

[b]試劑

2g/L蒽酮試劑:溶解2g蒽酮於1L濃硫酸(98%的濃硫酸)中,當日配製使用。

0.01g/L葡萄糖溶液(可加幾滴甲苯作防腐劑)

0.1g/L糖元溶液

[c]實驗器材

試管及試管架 吸量管(1ml,5ml) 恆溫水浴箱(100℃) 製冰機 紫外分光光度計 滴管 白瓷板

製作標準曲線

準確稱取0.1g葡萄糖(分析純),溶解並用蒸餾水定容至100ml後,分別取出1ml,2ml,3ml,4ml,5ml分別加入到50的容量瓶中,並用蒸餾水定容到50ml,配成濃度分別為20ug/ml,40ug/ml,60ug/ml,80ug/ml,100ug/ml,各取1ml於試管中,再加入3ml的蒽酮試劑,迅速浸入冰水中冷卻,待幾支試管均勻加完後,一起浸入100℃恆溫水浴箱中,為防止水分蒸發,應在試管口上加蓋一個玻璃球或者加一個塞子,自溫度重新升至100℃起計時,準確保溫10min後取出,用流動水冷卻,然後,於室溫中平衡片刻(約10min左右),在分光光度計上,波長620nm處,用0.5cm厚度的比色杯,以空白管做對照空白(此處的空白是指不加葡萄糖的蒽酮試劑,其他反應條件都一致),進行比色。

既得標準曲線。

如下表格

編號 1 2 3 4 5 6
體積ml 1(蒸餾水) 1 1 1 1 1
濃度ug/ml 0 20 40 60 80 100

[d]樣品測定

如上述條件一致,但要記得用除去蛋白質的樣品溶液進行測定,否則會影響測定結果。

樣品含糖量計算:

C×V2×D

樣品含糖量(%)=----------------------×100%

W×V1×10

其中C----在標準曲線上查出的糖含量(ug),

V2---提取液總體積(ml)

V1---測定時取用體積(ml)

D-----稀釋倍數

W-----樣品重量(g)

10-----樣品重量單位g換算成ug的倍數

注意事項:

1.一定要注意溫度要控制在100℃

2.從100℃開始準確計時10min,然後迅速冷卻,於室溫中平衡10min.

3.蒽酮要注意避光保存。配置好的蒽酮試劑也應注意避光,當天配製好的當天使用。

4.試管要保證乾燥清潔,無殘留水滴。

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