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1572年，在瑪格麗特·德·瓦盧瓦和納瓦拉的亨利婚典後發生一系列有內在關聯的事件。8月22日凱薩琳·德·美第奇指使天主教徒Maurevel, 試圖刺殺雨格諾派在巴黎的領袖,海軍將軍科利尼. 但是僅僅使他受了傷. 這次行動激怒了雨格諾派. 在8月24日聖巴托洛繆日黎明前的幾個小時, 科利尼和其他的12個雨格諾派的領袖在巴黎被暗殺,這一系列的暗殺只可能是由高層策劃的. 同時這也是普遍屠殺的信號. 8月24日到9月17日, 巴黎的暴徒看似自發的掀起了屠殺雨格諾派教徒的浪潮.
從8月到10月,看似自發的屠殺雨格諾派教徒的行動擴散到其他的城鎮.土魯斯, 波爾多, 里昂, Bourges, 魯昂, 和奧爾良都被波及. 死難者估計有10萬. 歷史學家通常認為是7萬. 死難者中包括作曲家Claude Goudimel.
當時報導死難者的屍體堆積在河裡長達數月,以至於沒人敢吃河裡的魚.教皇額我略十三世對此的非常高興: 所有羅馬的鐘都為感謝主的恩典而敲響, 一個特別的紀念幣為此而鍛造. 並且他委任了Giorgio Vasari繪製了一幅壁畫來慶祝這次屠殺.在巴黎,詩歌和音樂學院的創始人,詩人Jean-Antoine de Baïf寫下了極度讚美這次殺戮的十四行詩.聖巴托洛繆大屠殺不是法國宗教戰爭史上的第一次屠殺的,同時也不會是最後一次.
在1570年第三次戰爭以後,出現過和平的可能.天主教的狂熱分子吉斯家族在宮廷里失寵,取而代之的是希望找到解決方法的較為緩和的天主教徒.由於1570年8月簽訂的聖日耳曼敕令,雨格諾派占據了強大的軍事上位置. 他們控制了加固的城鎮拉羅歇爾, La Charité, 科尼亞克, 和Montauban. 凱薩琳·德·美第奇希望通過聯姻取得和平, 曾提議她的兒子安茹公爵（即後來的國王亨利三世）和英格蘭女王伊莉莎白一世結婚.
但是1571年, 和平的希望粉碎了。魯昂三月的一個星期天,在天主教徒遊行期間,40個雨格諾派的教徒因為拒絕在聖餅前跪下被殺. 由此雨格諾派和天主教徒的關係惡化.
吉斯派系被排斥出宮廷。而雨格諾派的領袖,海軍將軍科利尼在1571年9月被參議院重新接納. 吉斯家族痛恨科利尼有兩個原因: 他是雨格諾派的領袖, 他被認為捲入到1563年對第二代吉斯公爵弗朗索瓦·德·洛林的暗殺.
天主教徒在西班牙海軍名將奧地利的唐·胡安的組織下於1571年勒班陀戰役中擊敗奧斯曼帝國的艦隊。這向雨格諾派表明了天主教在西班牙國王腓力二世的領導下在西歐的復活。1572年4月'Sea Beggars'控制了Brielle，進而趨向控制尼德蘭. 而這對於法國則是一種壓力，它必須干涉尼德蘭的造反來防止西班牙干涉法國的新教活動. 科利尼是干涉尼德蘭的主要支持者。這有可能成為一次針對當時西歐天主教的最重要力量的西班牙的主要戰爭。
表面上為了減輕新教徒和天主教徒的敵意（其代表分別為波旁家族和吉斯家族），皇太后凱薩琳·德·美第奇安排波旁家族的繼承人納瓦拉的亨利（雨格諾派的領袖）和她的女兒瑪格麗特結婚。婚禮給予了將雨格諾派最重要的人聚集在一個地方的機會。凱薩琳因而計畫在屠殺為婚禮而聚集在城中的雨格諾派。但是她必須說服她的兒子查理九世，這並不是一件容易的事情，因為當時他和科利尼有非常好的關係。最後通過很多的爭論，查理九世變得激動並掌摑了他的母親，但是他還是決定執行屠殺，而且一旦進行就必須非常徹底(換句話說，他不想面對任何的報復，所以他命令斬盡殺絕).
