國家標準
GB 14755-2010 食品安全國家標準 食品添加劑 維生素D2（麥角鈣化醇）
本標準代替GB 14755-1993
本標準適用於以麥角甾醇為原料製得的食品添加劑維生素D2。
GB 14755-2010 維生素D2（麥角鈣化醇）
中華人民共和國國家標準
GB 14755—2010
食品安全國家標準
食品添加劑 維生素D2（麥角鈣化醇）
2010-12-21 發布 2011-02-21 實施
中華人民共和國衛生部 發布
前 言
本標準代替GB 14755—1993《食品添加劑 維生素D2 》。
本標準與GB 14755—1993 相比，主要變化如下：
——增加了紅外光譜鑑別；
——維生素D2的測定系統適用性試驗所用樣品由維生素D2改為維生素D3，高效液相色譜含量測定方法由內標法改為外標法；
——洋地黃皂苷試驗檢查麥角甾醇修改為薄層色譜法；
——增加了還原性物質指標和試驗方法；
——增加了重金屬指標和試驗方法；
——增加了砷指標和試驗方法。
本標準的附錄A 和附錄B 為規範性附錄，附錄C 為資料性附錄。
本標準所代替標準的歷次版本發布情況為：
——GB 14755-1993
食品安全國家標準
食品添加劑 維生素D2（麥角鈣化醇）
1 範圍
本標準適用於以麥角甾醇為原料製得的食品添加劑維生素 D2。
2 規範性引用檔案
本標準中引用的檔案對於本標準的套用是必不可少的。凡是注日期的引用檔案，僅所注日期的版本適用於本標準。凡是不注日期的引用檔案，其最新版本（包括所有的修改單）適用於本標準。
3 化學名稱、分子式、結構式和相對分子質量
3.1 化學名稱
9,10-開環麥角甾-5,7,10 （19）,22-四烯-3β-醇
3.2 分子式
C28H44O
3.3 結構式
3.4 相對分子質量
396.66 （按2007 年國際相對原子質量）
4 技術要求
4.1 感官要求：應符合表 1 的規定。
4.2理化指標：應符合表 2的規定。
檢驗方法
A.1 安全提示
本標準試驗方法中使用的部分試劑具有毒性或腐蝕性，按相關規定操作，使用時需小心謹慎。若濺到皮膚上應立即用水沖洗，嚴重者應立即治療。在使用揮發性酸時，要在通風櫥中進行。
A.2 一般規定
本標準所用試劑除非另有說明，在分析中僅使用確認為分析純的試劑和GB/T 6682—2008 中規定的三級水。
試驗方法中所用雜質測定用標準溶液、製劑及製品，在沒有註明其他要求時，均按 GB/T 602、GB/T 603 之規定製備。
A.3 鑑別試驗
A.3.1 醋酐濃硫酸呈色試驗
A.3.1.1 試劑和材料
A.3.1.1.1 三氯甲烷。
A.3.1.1.2 乙酸酐。
A.3.1.1.3 硫酸。
A.3.1.2 分析步驟
取約0.5 mg實驗室樣品，加5 mL三氯甲烷溶解後，加0.3 mL醋酐與0.1 mL硫酸，振搖，初顯黃色，漸變紅色，迅即變為紫色，最後變為綠色。
A.3.2 紅外光譜試驗
採用溴化鉀壓片法，按照GB/T 6040 進行試驗，實驗室樣品的紅外光譜應與對照的圖譜一致 （對照圖譜見附錄B ）。
A.4 維生素D2 的測定
A.4.1 方法提要
用高效液相色譜法，在選定的工作條件下，通過色譜柱使樣品分離，用紫外吸收檢測器檢測，用外標法定量，計算樣品中維生素D2 的含量。
A.4.2 試劑和材料
A.4.2.1 正戊醇：色譜純。
A.4.2.2 正己烷：色譜純。
A.4.2.3 異辛烷：色譜純。
A.4.2.4 維生素D2對照品。
A.4.2.5 維生素D3對照品。
A.4.3 儀器和設備
高效液相色譜儀（HPLC）。
A.4.4 色譜分析條件
推薦的色譜柱及典型色譜操作條件見表 A.1，維生素D3 系統適用性試驗高效液相色譜圖參見圖C.1，各組分的相對保留時間參見表C.1。其他能達到同等分離程度的色譜柱和色譜條件均可使用。
表A.1 色譜柱和典型色譜操作條件
色譜柱：柱長250mm，柱內徑4.6mm，矽膠色譜柱
流動相：正己烷-正戊醇（1000+3）
流速： 2mL/min
檢測器檢測波長： 254 nm
A.4.5 分析步驟
A.4.5.1 維生素D3對照品系統適應性試驗貯備液的製備
稱取約25mg 維生素D3 對照品，精確至 0.0001g，置 100mL 棕色容量瓶中，加80mL 異辛烷，用超聲處理助溶 1min，避免加熱，使完全溶解，再加異辛烷至刻度，搖勻充氮密塞，避光，0℃以下保存。
A.4.5.2 實驗室樣品溶液的製備
稱取約25mg 實驗室樣品，精確至0.0001 g，置100mL 棕色容量瓶中，加80mL 異辛烷，用超聲處理助溶 1min，避免加熱，使完全溶解，再加異辛烷至刻度，搖勻。量取5mL±0.05mL 上述溶液，置10mL棕色容量瓶中，加正己烷至刻度，搖勻。
A.4.5.3 維生素D2對照品溶液的製備
稱取約25mg 維生素D2對照品，精確至 0.0001g，置 100mL 棕色容量瓶中，加80mL 異辛烷，用超聲處理助溶1min，避免加熱，使完全溶解，再加異辛烷至刻度，量取上述溶液5mL±0.05mL，置10mL 棕色容量瓶中，加正己烷至刻度，搖勻。
A.4.5.4 系統適用性試驗
以矽膠為填充劑的色譜柱，正己烷-正戊醇（1000+3）為流動相，檢測波長254nm，流速約為2mL/min 。量取維生素D3對照品貯備溶液5mL，置具塞玻璃容器中，充氮後密塞，置90℃水浴加熱1h，取出迅速冷卻，加正己烷5mL±0.05mL，搖勻，置1cm具塞石英吸收池中，在2支主波長分別為254nm和365nm的紫外光燈下，將石英吸收池斜放成45°，並距燈管5cm～6cm，照射5min，使溶液中含有前維生素D3、反式維生素D3 、維生素D3和速甾醇D3。取此溶液注入液相色譜儀，測定維生素D3的峰值，先後進樣5次，相對標準偏差應不大於2.0%，前維生素D3（與維生素D3的比保留時間為0.5）與反式維生素D3（與維生素D3 的比保留時間約為0.6）以及維生素D3與速甾醇D3 （與維生素D3的比保留時間約為1.1）的峰分離度均應大於1.0。
A.4.5.5 測定
取20μL實驗室樣品溶液注入液相色譜儀,記錄色譜圖，另取維生素D2對照品溶液，同法測定。
按外標法以峰面積計算出供試品中維生素D2 的含量。
A.4.6 結果計算
根據色譜圖計算維生素D2 的質量分數w1 ，數值以%表示，按公式(A.1)計算
式中：
m1——對照品溶液中維生素D2的進樣量的數值，單位為微克（μg）；
A2——實驗室樣品溶液中維生素D2的峰面積的數值；
A1——對照品溶液中維生素D2 的峰面積的數值；
m2——實驗室樣品溶液中維生素D2的進樣量的數值，單位為微克（μg）。
取兩次平行測定結果的算術平均值為測定結果，兩次平行測定的允許絕對差不大於 1.5 %。
麥角甾醇的測定
A.5.1 方法提要
將維生素D2 溶液點樣於薄層板上，經展開，顯色後，所得的色譜圖與對照品溶液按同法所得的色譜圖作對比，對維生素D2 進行雜質檢查。
A.5.2 試劑和材料
A.5.2.1 角鯊烷氯仿溶液：10 g/L。
A.5.2.2 展開劑:環己烷-乙醚（1+1）。
A.5.2.3 維生素D2對照品。
A.5.2.4 麥角甾醇對照品。
A.5.3 分析步驟
A.5.3.1 對照品溶液的配製
稱取約 50mg 維生素D2對照品，精確至 0.0002g，用 1mL 角鯊烷氯仿溶液溶解，得對照品溶液。
A.5.3.2 實驗室樣品溶液的配製
稱取約50mg維生素D2實驗室樣品，精確至0.0002g，用1 mL角鯊烷氯仿溶液溶解，得實驗室樣品溶液。
A.5.3.3 麥角甾醇對照溶液的配製
稱取約5mg麥角甾醇對照品，精確至0.1mg，置於50mL容量瓶中，加角鯊烷氯仿溶液40mL溶解並稀釋至刻度，搖勻。
A.5.3.4 顯色劑的配製
取1.0g三氯化銻，加20mL乙醯氯溶解。
A.5.3.5 測定
分別取10μL對照品溶液、實驗室樣品溶液及麥角甾醇對照溶液，分別點於以羧甲基纖維素鈉為粘合劑的矽膠G 薄層板上，用展開劑暗處展開，晾乾，用顯色劑顯色。實驗室樣品溶液與對照品溶液的主斑點R f值及顏色應一致，實驗室樣品溶液的雜質斑點不得深於麥角甾醇對照溶液相應的斑點。
A.6 比旋光度的測定
A.6.1 試劑和材料
無水乙醇。
A.6.2 儀器和設備
旋光儀。
A.6.3 分析步驟
取實驗室樣品適量，精確至0.0002g，加無水乙醇製成1mL中約含40mg的溶液，其他按GB/T613-2007規定的方法進行。（註：在溶液配製後30min內測定）。
A.6.4 結果計算
比旋光度аm(20℃,D)按公式(A.2)計算：
式中：
α——得的旋光角,單位為度(°)；
l——旋光管的長度,單位為分米(dm)；
ρα—— 溶液中有效組分的質量濃度,單位為克每毫升(g/mL)。
A.7 質量吸收係數的測定
A.7.1 試劑和材料
無水乙醇。
A.7.2 儀器和設備
分光光度儀。
A.7.3 分析步驟
稱取實驗室樣品適量，精確至0.0002g，加乙醇製成每1mL中約含10μg樣品的溶液，按照GB/T9721在265nm±1nm的波長處測定吸光度A ，求其質量吸收係數。
A.7.4 結果計算
根據吸光度A計算維生素D2 的質量吸收係數α，數值以 ( º)·dm2·kg -1表示，按公式(A.3)計算：
式中：
A——樣品溶液的吸光度的數值；
b——光路長度（即吸收池厚度）的數值，單位為厘米（cm）；
ρα——實驗室樣品溶液的質量濃度的數值，單位為克每升（g/L）。
A.8 還原性物質的測定
A.8.1 方法原理
還原性物質在強鹼性溶液中能將四唑藍還原為有色甲月替（formazan），與對甲二酚無水乙醇還原物質的標準溶液顏色比較做限量檢查。
A.8.2 試劑和材料
A.8.2.1 無水乙醇。
A.8.2.2 甲醇。
A.8.2.3 冰乙酸。
A.8.2.4 四唑藍甲醇溶液：50mg/mL。
A.8.2.5 羥化四甲銨溶液：羥化四甲銨水溶液(100 g/L) -無水乙醇（1+9）。
A.8.2.6 對甲二酚無水乙醇溶液：0.2μg/mL。
A.8.3 分析步驟
A.8.3.1 實驗室樣品溶液的製備
稱取約0.1g實驗室樣品，精確至0.001g，溶解於無水乙醇中，稀釋至10mL，加入0.5mL四唑藍甲醇溶液和0.5mL羥化四甲銨溶液，靜置5min，加入1.0mL冰乙酸，搖勻。
A.8.3.2 對照溶液的製備
量取10mL±0.05mL 0.2μg/mL對甲二酚無水乙醇溶液，加入0.5mL四唑藍甲醇溶液和0.5mL羥化四甲銨溶液，靜置5min，加入1.0mL冰乙酸，搖勻。
A.8.3.3 空白溶液的製備
取10mL 無水乙醇，加入0.5mL 四唑藍甲醇溶液和0.5mL 羥化四甲銨溶液，靜置 5min，加入1.0mL 冰乙酸，搖勻。
A.8.3.4 測定
在525nm波長處，用空白溶液調零，分別測定實驗室樣品溶液與對照溶液的吸光度，實驗室樣品溶液的吸光度不得大於對照溶液。
A.9 砷的測定
取5g±0.01g實驗室樣品，用乾灰化法處理樣品。取相同量的氧化鎂、硝酸鎂與試樣同法處理，做試劑空白試驗。量取10mL±0.05mL砷標準溶液（含砷2.0μg），同法處理，製備砷限量標準。按GB/T5009.76—2003砷斑法的規定進行。
重金屬的測定
A.10.1 試劑和材料
A.10.1.1 硝酸。
A.10.1.2 硫酸。
A.10.1.3 鹽酸。
A.10.1.4 甘油。
A.10.1.5 乙酸銨。
A.10.1.6 硝酸鉛。
A.10.1.7 硫代乙醯胺。
A.10.1.8 氨試液：400→1000。
A.10.1.9 氫氧化鈉溶液：c（NaOH）=1mol/L。
A.10.1.10 鹽酸溶液：c（HCl）=2mol/L。
A.10.1.11 鹽酸溶液：c（HCl）=7mol/L。
A.10.1.12 氨水溶液：c（NH3·H2O）=5mol/L。
A.10.1.13 酚酞指示液：10g/L乙醇溶液。
A.10.1.14 乙酸鹽緩衝液（pH3.5）：取25g乙酸銨，加水25mL溶解後，加7mol/L鹽酸溶液38mL，用2mol/L鹽酸溶液或氨水溶液準確調節pH至3.5（pH計），用水稀釋至100mL。
A.10.1.15 硫代乙醯胺試液：取4g硫代乙醯胺，精確至0.01g，加水使溶解成100mL，置冰櫃中保存。臨用前取5.0mL混合液（由1mol/L 15mL氫氧化鈉溶液、5.0mL水及20mL甘油組成），加上述1.0mL硫代乙醯胺溶液，置水浴上加熱20s，冷卻，立即使用。
A.10.1.16 鉛標準溶液：稱取0.160g硝酸鉛，精確至0.0002g,置於1000mL容量瓶中，加5mL硝酸與50mL水溶解後，用水稀釋至刻度，搖勻，作為貯備液。臨用前，移取（10±0.02）mL貯備液，置於100mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得（每1mL相當於10 µg的Pb）。配置與貯存用的玻璃儀器均不得含鉛。
A.10.2 分析步驟
按《中華人民共和國藥典》2005年版二部 附錄Ⅷ H 重金屬檢查法第二法，具體方法如下：
取 1g±0.01g 實驗室樣品，緩緩灼燒至完全炭化，放冷，加0.5mL～1.0mL 硫酸，使恰濕潤，用低溫加熱制硫酸除盡後，加0.5mL 硝酸，蒸乾，至氧化氮蒸氣除盡後，放冷，在 500℃±50 ℃熾灼至完全灰化，放冷，加2 mL 鹽酸，置水浴上蒸乾後加 15mL 水，滴加氨試液至對酚酞指示液顯中性，再加2 mL 乙酸鹽緩衝液（pH3.5 ），微熱溶解後，移置納氏比色管甲管中，加水稀釋成25mL；另取配製實驗室樣品溶液的試劑，置瓷皿中蒸乾後，加2mL 乙酸鹽緩衝液（pH3.5 ）與15mL 水，微熱溶解後，移置納氏比色管乙管中，加2 mL±0.02mL 標準鉛溶液，再用水稀釋成25mL；再在甲乙兩管中分別加2mL 硫代乙醯胺試液，搖勻，放置 2min，同置白紙上，自上向下透視，甲管中顯示的顏色與乙管比較，不得更深。
附 錄 B
（規範性附錄）
維生素D2紅外光譜圖
註：引自《藥品紅外光譜集》第一卷（1995）
圖B.1 維生素D2紅外光譜圖
附 錄 C
（資料性附錄）
系統適用性試驗高效液相色譜圖和相對保留時間
