石杉鹼甲研究

石杉鹼甲：又名Huperzine A，是我國藥學工作者於上世紀八十年代從蕨類藥用植物“蛇足草”中發掘出來的具有乙醯膽鹼酯酶顯著抑制作用的新型化學物質，現已在我國研發成用於治療老年良性記憶障礙、改善由腦內膽鹼 能功能缺陷引起的阿爾茨海默氏症患者的記憶功能，以及緩解重症肌無力等疾病的新藥。《新藥石杉鹼甲的發現》記述了石杉鹼甲的發現和研究的一些史實，同時也首次報告了一些有關的科學研究數據以及對石杉鹼甲結構特徵、互變異構體等的闡述。 ［關鍵字］蛇足草，千層塔，石杉鹼甲，老年性痴呆症，阿爾茨海默氏症，Huperzine A 《新藥石杉鹼甲的發現》，刊登在《浙江省醫學科學院學報》，2016，27(1)：44-47

新藥石杉鹼甲的發現
俞超美
（原浙江省醫學科學院，杭州310013）
中草藥有效成分石杉鹼甲是中國藥學工作者於20世紀80年代發現的一種具有全新化學結構的新一代高效、高選擇性和可逆的乙醯膽鹼酯酶抑制劑。它的首次發現源自於一種鄉間俗名為＂蛇足草＂（又名千層塔）的石杉科蕨類植物，其學名鑑定為LycopodiumserratumThunb.，後更名為Huperziaserrate(Thunb.)Trevis.[1]。石杉鹼甲顯著的藥理作用和臨床療效[2-4]，現已在中國研發成用於治療老年良性記憶障礙、改善由腦內膽鹼能功能缺陷引起的阿爾茨海默氏症患者的記憶功能，以及緩解重症肌無力等疾病的新藥，並於2005年收載予中國藥典[5]。石杉鹼甲的發現不僅是中國中草藥乃至世界植物藥研究的重大成果和成功典範，而且也是中國在自主智慧財產權的新藥發明史上的驕傲。本文記述了石杉鹼甲的發現和研究的一些史實，同時也首次報告了有關的科學研究數據以及對石杉鹼甲結構特徵、互變異構體等的闡述。
作為第一發明人[6]，作者親歷了石杉鹼甲的發現以及其生產工藝的創建和完善的整個過程。1971年，當時的浙江省衛生實驗院（現浙江省醫學科學院，以下簡稱浙江省醫科院)藥物研究所在開展浙江省民間中草藥調查和整理過程中，發現藥用植物蛇足草在浙南地區用於治療跌打損傷，並具有退熱、除濕、消瘀、止血等功能[7]。1972年，浙江省醫科院藥物所沈文照同志負責的浙江省蛇足草研究協作組開展了對蛇足草化學成分的研究，首次報導該植物的生物鹼在動物實驗上有橫紋肌鬆弛作用。後又經臨床試驗證明，其有效的化學部位屬非酚性強鹼性生物鹼[8-9]。1975年，上海精神病防治院報導用該草藥煎劑治療精神分裂症有效。1979年4月至1980年2月，浙江省蛇足草研究協作組用蛇足草中提取的強鹼性總生物鹼製成的“蛇足草Ⅲ號片”對精神分裂症進行了試治，但此課題因臨床療效不甚顯著（治療精神分裂症114例中，顯著進步10例，有進步29例，無效者75例)[10]，最後伴隨著當時的中草藥運動的消聲匿跡而終止。
1981年，作者在中科院上海藥物所作短期的訪問和工作。該年3月，在沈文照同志的同意下並經當時浙江省醫科院藥物所領導的批准，作者被授權對植物蛇足草的生物鹼成分開展進一步的研究。經初步研究，從72克蛇足草非酚性總鹼中，首次分得5個結晶性生物鹼，其中3個被鑑定［11］。1982年初，作者從上海藥物所回來，重新審視了其對蛇足草活性化學成分的初步研究，認識到該植物含有眾多石杉生物鹼的複雜性。鑒於常規用於生物鹼薄層層析檢出和柱層析分離的氧化鋁吸附劑分離效果的不理想，首次構想和嘗試對矽膠吸附劑進行鹼化處理[12]。經過無數次製法條件的摸索和分離實驗，獲得了其對石杉生物鹼類分離效果上的突破，這為後來的研究成果奠定了很重要的基礎。另外，作者決定改變研究方向，確立了將以往不曾重視的酚性生物鹼類提取物作為進一步探索生物活性成分分離研究的新目標。
新的研究開展後，在送往上海藥物所藥理室的幾份從柱層析實驗粗分得到的樣品中，唐希燦同志發現它們在動物實驗中顯示了明顯的抑制乙醯膽鹼酯酶的活性。1982年3月17日，從有活性的流分混合物中又進一步分離到了類白色的結晶單體。隨後，該單體被進一步證明具有顯著的乙醯膽鹼酯酶抑制活性(唐希燦.私人通信,1982.)，並擇代號為“317”，後正式命名為＂石杉鹼甲＂。
石杉鹼甲單體的發現和其展現的顯著生物活性令人鼓舞。上海藥物所唐希燦和朱元龍二同志主動前來洽談，提出了他們希望參與石杉鹼甲進一步研究的要求，並簽訂了進行共同研究的協定。由於協定的簽訂和較好的研究前景，促使了當時浙江省醫科院和藥物所領導對該研究的極其重視，破例地為還是實習研究員的作者向當時的省科委補報了課題，並獲得了一些特別經費的支持。此後，為開展下一步的化學、動物和臨床試驗等研究製備足夠量的石杉鹼甲材料，同時為建立並完善石杉鹼甲的生產工藝，當時的伏緯華院長和周有作所長親自帶隊和作者乘坐長途汽車，在山區的泥坑路上經受長達七、八個小時之久的顛簸，奔赴浙南地區商議草藥蛇足草的大量收購亊項。在時任台州地區藥檢所所長李德英的熱情協助下，與當地有關部門落實了對所需蛇足草的收購工作。這些前瞻性的策劃為接下去的科研工作提供了後備保障。
從草藥蛇足草中分離石杉鹼甲單體是一個從大量到小量、從粗到精、繁雜和冗長的研製過程，它包括：藥材的收購和粉碎；植物成分的乙醇提取和濃縮以獲取總植物成分提取物；總植物成分提取物經酸液捏溶、氨水鹼化、氯仿萃取，然後濃縮以獲取總生物鹼；總生物鹼用強鹼性溶液萃取、萃取液經酸鹼度調節，然後用氯仿萃取以獲得酚性生物鹼和非酚性生物鹼的分離；大型柱層析用的鹼性矽膠的製備；酚性生物鹼的製備性柱層析分離、流分接收、鹼性矽膠薄層層析對目標流分檢出和合併以獲取石杉鹼甲粗品；最後通過重結晶獲取石杉鹼甲的精品。在實驗中，作者還觀察到石杉鹼甲在丙酮溶劑的結晶過程中形成二種晶體，它們呈現不同的紅外吸收光譜。
石杉鹼甲在結構上不具有酚羥基，它之所以能被用於酚性化合物提取的方法萃取是因為其結構A環的2-吡啶酮在非極性溶液中能形成它的互變異構體2-羥基吡啶，而後者就含具有弱酸性的酚性羥基。這種在溶劑中產生的互變異構現象在1%NaOH溶液中會失去平衡，直接驅使這互變平衡中的2-羥基吡啶完全轉化成可以在鹼性溶液中溶解的2-羥基吡啶鈉鹽。依此原理，石杉鹼甲不光可以形成它的鹽酸鹽，也是可以形成它的鈉鹽以增加它的水溶度。
1983年，一共收購了蛇足草464.2公斤，被分成8批次提取分離。其乙醇提取工序是借用了藥材收購地的當地方藥廠的設備分批完成的。其中，6批採用了乙醇熱回流提取法，而最後2批採用了乙醇滲漉法。經比較，滲漉法獲得的提取物含較少色素，但二法所致的石杉鹼甲的得率無明顯差異。
從乙醇提取的總植物成分中萃取總生物鹼的工作是在浙江省醫科院藥物所植化室進行的。由於生產批次多且量大，在蛇足草乙醇提取物經酸液捏溶、鹼化後用氯仿萃取總生物鹼的步驟中曾用到了容積大至50立升的蒸餾水瓶（具放水下口）作為分液漏斗，通過將其在實驗台的鋪墊上滾搖進行萃取。記得那時候實驗室無特殊通風設定，由於提取期間對氯仿的長時間接觸，竟能讓人從實驗人員的呼出氣中嗅到濃濃的氯仿溶劑味，用畢的氯仿試劑瓶堆積似小山。總鹼的萃取工作是在植化室同事韓燕藝、吳鳳梧和戚寶鳳等同志的協助下一起完成的。隨後的酚性生物鹼的萃取以及石杉鹼甲的製備性柱層析分離是與韓燕藝等同志一起經過數月的艱苦努力完成的。通過7批次的製備，累計獲得石杉鹼甲48克，平均得率為9.87×10-5，每克大約相當於生藥量9.7公斤。根據作者設計的生產流程進行如此多批次的實踐操練，這為1983年末的石杉鹼甲生產工藝的形成、完善和起草提供了寶貴的第一手資料和可靠的科學依據，也為石杉鹼甲的化學結構、藥理作用、劑型、質量標準制定等的進一步研究，以及為後來的重症肌無力和老年性記憶減退患者的臨床試治準備了藥源。
在石杉鹼甲化學結構的初步鑑定中，作者發現其與文獻中報導的石杉生物鹼Selagine［13]在熔點、紅外特徵吸收及分子量諸分面極相似，但是二者鏇光率達51度的顯著差異。由於省醫科院無條件作進一步結構分析，遂將石杉鹼甲和與其同時分離獲得的化合物石杉鹼乙（HuperzineB）送交協作單位上海藥物所，委託劉嘉森同志協助分析。核磁共振結構分析發現：石杉鹼甲在環內雙鍵烯碳8位上的質子由於受到鄰位叔碳上的質子的隅合呈現雙峰，而Selagine的結構，其環內雙鍵中含烯氫質子的烯碳是在14位，由於其鄰位無質子偶合而應顯示單峰。此外，二者的環外雙鍵也呈現相反構形。正是因為二者結構具有如此顯著的差異性，這就在根本上徹底地否定了石杉鹼甲為已知生物鹼Selagine的可能性，從而確立了石杉鹼甲化學結構的新異性以及它在天然產物化學文獻和中草藥中發掘新藥的研究中的創新地位。
石杉鹼甲和石杉鹼乙及其被製備的一些衍生物連同它們的藥理作用在1985年申請，1993年獲得美國專利（#5,177,082）[6]。該專利後來由於當時缺乏經驗而導致過期，但是仍在美國專利局的資料庫中記錄在案並可查閱。1985年4月25日，當時的浙江省衛生廳召開了鑑定會，對石杉鹼甲的化學結構、藥理作用、質量標準等進行了討論並一致通過鑑定。1985年底，被委託者劉嘉森則以第一和通訊作者的雙重身份發表了關於石杉鹼甲和石杉鹼乙的化學結構的論文[14-15]。1986年12月9日浙江省醫科院藥物所和上海藥物所對石杉鹼甲及其注射液的研究獲國家衛生部乙級科技獎。1987年浙江省醫科院藥物所和上海藥物所對石杉鹼甲及其注射液的研究獲浙江省科技成果二等獎（獲獎人：俞超美，唐希燦，劉嘉森和韓燕藝）。之後，在申報國家科研成果時，浙江省醫科院藥物所和上海藥物所所申請的“真性膽鹼酯酶抑制劑新藥-石杉鹼甲”的課題，與中國軍事科學院毒物藥物研究所從石杉科馬尾杉屬的華南馬尾杉中分離得到並命名為“福定鹼”的相同化合物的類似研究課題相遇。1987年9月，浙江省醫科院藥物所和上海藥物所偕同中國軍事醫學科學院毒物藥物研究所對石杉鹼甲的新藥研究首次共獲中國發明協會第三屆全國發明金獎［獲獎人：俞超美(浙江省醫科院藥物所)，徐擇鄰(中國軍事科學院)，唐希燦(中科院上海藥物所)，劉嘉森(中科院上海藥物所)，韓燕藝(浙江省醫科院藥物所)，趙慶余(中國軍事科學院)，秦伯益(中國軍事科學院)和周有作(浙江省醫科院藥物所)；參見中科院上海藥物所科研成果網頁http://www.simm.cas.cn/kycg/hj/index_3.html]。數月之後，於1987年12月浙江省醫科院藥物所和上海藥物所又再次偕同中國軍事醫學科學院毒物藥物研究所對石杉鹼甲的新藥研究共享國家科技發明二等獎（A02720）。這裡值得一提的是，正如此前在接受中國發明協會頒發金獎時由各方認同的獲獎人排列順序之顯示，它體現了我方當時不論在石杉鹼甲的新化學結構闡明和藥理研究重要論文的正式發表方面，還是在臨床研究、生產工藝和新藥鑑定的通過等諸方面均領先於對方對福定鹼研究的不爭事實。國際上所有著名文獻索引（如美國化學文摘，默克索引，等等）、權威雜誌上發表的有關的化學和藥理研究論文以及後來2005年版《中國藥典》均接納和肯定了我們為該具有顯著乙醯膽鹼酯酶抑制作用的生物鹼所冠的＂石杉鹼甲（HuperzineA）＂之名。儘管如此，雙方在獲取國家發明獎前夕曾對各方發明人的名額和排列順序進行了新的協商，最後我方以第一發明人讓位給軍科院人員的代價換取了多於對方二名發明人的署名權(劉嘉森.私人通訊2015)。
說也湊巧，之前文獻報導生物鹼Selagine的是作者的博士生導師Wiesner教授（已故加拿大著名天然產物化學家）和Valenta教授等人於1960年從當地的LycopodiumslagoL.中發現，並通過一些化學降解的經典手段和初級的60兆周核磁共振儀的分析解決了它的化學結構。就在石杉鹼甲的化學結構聞世3年之後，石杉鹼甲和Selagine之間的結構之迷終於被加拿大Alberta大學Ayer教授（Wiesner教授早期學生）的研究小組揭開了:他們在Alberta省採集了得到過Selagine的同種植物並進行了重複研究。藉助於現代光譜分析，他們發現從該植物中分離到的Selagine不僅與Wiesner教授實驗室里過去29年前唯一倖存的、曾用於紅外光譜分析的溴化鉀壓片中的Selagine樣品（由二氯甲烷從中萃取而得）一致，而且也與石杉鹼甲的結構吻合[16]。同時，他們也證明台灣學者報導的石杉生物鹼Isoselagine[17]也與石杉鹼甲同屬一物[16]。平心而論，憑著早年的實驗條件，能如此推解出僅與石杉鹼甲雙鍵位置和構向不同的Selagine分子骨架已屬不易。它們之間所報導的鏇光度差異也被推測是當年參與的研究人員由於儀器用前校準不當或測定疏忽等因素所致（ValentaZ.私人通訊，1989.）。
藥用植物蛇足草的化學成分研究以及其有效成分石杉鹼甲的發現是浙江省醫科院先前歷史性研究課題的繼續和成果，中科院上海藥物所是參與其研究的協作單位。乙醯膽鹼酯酶抑制劑石杉鹼甲的發明距今已30多年過去了，很多史實已漸漸被淡忘，文獻引用也出現了許多訛傳[18-20]。作為當年研究的重要參與者，作者負責任地說，那些與此史實不同的都是美麗的故事，缺乏事實依據。另外，首次報告石杉鹼甲和石杉鹼乙的發現和結構分析論文[14-15]的第一作者和參與單位的署名順序，以及之後與石杉鹼甲研究直接有關的2000年度國家自然科學二等獎名單中浙江省醫科院的缺如[21]，都無法改變浙江省醫科院在發明新藥石杉鹼甲中所作出主要貢獻的史實。
石杉鹼甲，由於其化學結構的特異性，它對乙醯膽鹼酯酶抑制作用的高效、高度選擇和可逆性，以及它在當代醫學難題老年性痴呆症展示的顯著療效，引起了國內外藥學研究者們的極大興趣，並掀起對它的研究熱潮，由此發表的論文至今仍層出不窮。近年來的研究還證明，石杉鹼甲通過對抗β-澱粉樣蛋白（一種被認為與早老性痴呆症致病有關的物質）產生的氧化應激毒性、調控神經細胞凋亡和促進神經生長因子生長，以及具有保護神經細胞等作用[22-24]。這些研究給人的啟示是石杉鹼甲對早老性痴呆病變不光有抑制還有改善的雙重功效。至於在化學研究方面，化學家們對石杉鹼甲的化學結構進行了包括全合成、結構簡化、衍生物製備等等研究[25]。1989年，Kozikowski等率先報導了對石杉鹼甲全合成的成功[26]，其後他又與藥理研究的有關人員一起對其構-效關係作出了一些研究。他們認為，具有手性碳7-位和13-位的R-構形的天然石杉鹼甲分子，在與乙醯膽鹼脂酶作用中，要比從化學合成中形成的消鏇混合物中分離到的石杉鹼甲的光學對映體有更好的立體選擇性和結合性[27]，如此有效的結合形式似乎也印證了石杉鹼甲對乙醯膽鹼脂酶的抑制所具有的顯著性和專一性。1999年，美國FDA根據中國現有的藥理和臨床研究報告文獻批准了石杉鹼甲在旨在於提高記憶功能的美國保健產品中的使用[28]。至2000年，上海藥物所朱大元等又從該科植物中共分得了60多個生物鹼，並對石杉鹼甲的結構進行了化學修飾，還從中發現了乙醯膽鹼酯酶抑制作用明顯的衍生物希普林(ZT-1)，現正試圖將其開發成新一代的乙醯膽鹼酯酶抑制劑[21]。
綜觀石杉鹼甲的發現和研究進展，作者充分相信，隨著它在阿爾茨海默氏症患者治療中的進一步套用以及對它在分子藥理方面更深層的研究，這不僅能促進人類對此疾病更深刻的了解，也將進一步為攻克這一人類頑疾的新藥設計和研究提供新的思路和開闢更完美的研製途徑。
ThediscoveryofHuperzineA,anewdrugofremarkableacetylcholinesteraseinhibition
Chao-MeiYu
Abstract:HuperzineA,aLycopodiumalkaloid,wasdiscoveredfromatraditionalfolkherbHuperziaserrate(Thunb.)Trevis.inthe1980sinChinabypharmaceuticalscientistsatthelaboftheZhejiangAcademyofMedicine,anditsfurtherstudieswerecarriedoutbycollaborationwiththeShanghaiInstituteofMateriaMedicaandsomecliniciansatTheSecondAffiliatedHospitalofZhejiangMedicalUniversity.HuperzineAexhibitsremarkableinhibitionofacetylcholinesteraseactivity,andhasnowbeendevelopedandapprovedinChinaasanewdrugforthetreatmentofAlzheimer’sdementiaandimprovementofsenilememorylossaswellasforthetreatmentofmyastheniagravis.ThisreviewrecordshistoricfactsinthediscoveryofHuperzineAandpresentsforthefirsttimesomenewrelevantscientificdataanddiscussions.
Keywords:HuperzineA,Lycopodiumalkaloid,Alzheimer’sdisease,seniledementia,memorydisorders
【俞超美】：本文作者，博士，現為加拿大聯邦衛生部FDA資深藥物評審顧問。1976年至1985年為浙江省醫學科學院藥物所植化室工作；1985年2月赴加拿大NewBrunswick大學留學，於1989年獲有機化學博士；1990年至1996年於加拿大國家海洋研究所從事海洋生物和真菌代謝產物的有效成分研究；1997年受聘於加拿大聯邦衛生部藥品質量評審局；1999年被授予浙江省醫學科學院客座研究員；2005年獲選美國藥典專家委員會成員。
【注釋】：植物蛇足草的配圖源自網際網路；有關此原文，請參見期刋論文：俞超美.新藥石杉鹼甲的發現[J].浙江省醫學科學院學報，2016，27(1)：44-47.
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