簡介
HIC：疏水相互作用層析，是根據不同的生物大分子疏水性的強弱而達到分離純化的目的。
疏水作用層析（HydrophobicInteractionChromatography，HIC）
是根據分子表面疏水性差別來分離蛋白質和多肽等生物大分子的一種較為常用的方法。蛋白質和多肽等生物大分子的表面常常暴露著一些疏水性基團，我們把這些疏水性基團稱為疏水補丁，疏水補丁可以與疏水性層析介質發生疏水性相互作用而結合。不同的分子由於疏水性不同，它們與疏水性層析介質之間的疏水性作用力強弱不同，疏水作用層析就是依據這一原理分離純化蛋白質和多肽等生物大分子的。
溶液中高離子強度可以增強蛋白質和多肽等生物大分子與疏水性層析介質之間的疏水作用。利用這個性質，在高離子強度下將待分離的樣品吸附在疏水性層析介質上，然後線性或階段降低離子強度選擇性的將樣品解吸。疏水性弱的物質，在較高離子強度的溶液時被洗脫下來，當離子強度降低時，疏水性強的物質才隨後被洗脫下來。
疏水相互作用層析根據蛋白表面疏水性的不同，利用蛋白和疏水層析介質疏水表面可逆的相互作用來分離蛋白。運行所用緩衝液中的某種鹽的存在會顯著影響疏水蛋白和疏水層析介質的相互作用。高濃度的鹽會增強相互作用，而低濃度的鹽減弱相互作用。所有單個蛋白都和疏水相互作用層析介質的疏水表面相互作用，但是，隨著緩衝液中里子強度的降低，相互作用逆轉了，具有最低程度疏水性的蛋白最先被洗脫。具有最強相互作用的蛋白最後被洗脫，這需要鹽濃度降得更低來逆轉相互作用。
疏水相互作用層析填料上疏水配基和蛋白質疏水表面相互作用。在純水中，任何疏水效應都太弱而不能導致配基和蛋白之間或蛋白自身的相互作用。然而，某些鹽能增強疏水相互作用，加入這些鹽導致到疏水相互作用的結合（吸附）。對於選擇性洗脫，鹽濃度逐步的降低，樣品組分根據疏水性的依次洗脫。
實驗一. 疏水作用層析
疏水作用層析的基本原理如圖所示【實驗原理】
疏水作用層析（HydrophobicInteractionChromatography，HIC）是根據分子表面疏水性差別來分離蛋白質和多肽等生物大分子的一種較為常用的方法。蛋白質和多肽等生物大分子的表面常常暴露著一些疏水性基團，我們把這些疏水性基團稱為疏水補丁，疏水補丁可以與疏水性層析介質發生疏水性相互作用而結合。不同的分子由於疏水性不同，它們與疏水性層析介質之間的疏水性作用力強弱不同，疏水作用層析就是依據這一原理分離純化蛋白質和多肽等生物大分子的。疏水作用層析的基本原理如圖所示。
溶液中高離子強度可以增強蛋白質和多肽等生物大分子與疏水性層析介質之間的疏水作用。利用這個性質，在高離子強度下將待分離的樣品吸附在疏水性層析介質上，然後線性或階段降低離子強度選擇性的將樣品解吸。疏水性弱的物質，在較高離子強度的溶液時被洗脫下來，當離子強度降低時，疏水性強的物質才隨後被洗脫下來。
Phenyl-SepharoseTM6FastFlow是疏水性層析介質的一種，這種層析介質是以交聯瓊脂糖為支持物，交聯瓊脂糖支持物與苯基共價結合。苯基作為疏水性配體，可以與疏水性物質發生疏水作用。Phenyl-SepharoseTM6FastFlow結構示意圖如下。
【實驗材料】
1．實驗器材
層析柱（1.6X20cm）；恆流泵；梯度混合器；試管及試管架；紫外分光光度計
2．實驗試劑
（1）疏水層析介質：Phenyl-SepharoseTM6FastFlow
（2）溶液A：0.1MNa2HPO4,pH7.0
（3）溶液B：0.1MNa2HPO4,pH7.0，1.7M(NH4)2SO4
（4）蛋白質樣品溶於溶液B
【實驗操作】
1.層析介質準備：Phenyl-SepharoseTM6FastFlow疏水層析介質保存在20%乙醇中，取出層析介質後，傾出乙醇溶液。加入溶液A，溶液的體積約占總體積的1/4。
2.裝柱：將層析柱洗淨，固定在鐵架台上，層析柱下口用螺鏇夾夾緊。加入溶液B，打開下口讓溶液流出，排出殘留氣泡，柱中保留高度約2厘米的溶液。將準備好的層析介質輕輕攪勻，用玻璃棒引流，沿層析柱內壁將層析介質緩慢加進柱中。等到層析介質在柱中沉積高度超過1厘米時，打開下口。柱床高度達到6-8厘米時關閉下口，裝柱儘可能一次裝完，避免出現界面。
3.柱平衡：用溶液B平衡1-2個床體積。注意始終保持層析介質處於溶液中，不要乾柱。
4.上樣：取樣品加入平衡好的層析柱，並收集層析柱下口流出組分，調節流速為1ml/min,每管3ml。
5.洗滌：用溶液B洗滌1個床體積，洗去上樣不吸附組分。收集層析柱下口流出成分。
6.洗脫與收集：梯度混合器左面裝入250ml溶液A，右面裝入250ml溶液B。按照100%-0%1.7M(NH4)2SO4梯度洗脫500ml，收集洗脫液。
7.檢測：取各收集管樣品，280nm處測定紫外吸收。
8.疏水層析介質清洗與保存：層析介質先用水清洗，然後用0.5MNaOH洗脫，最後用水洗至中性。處理好的層析介質放在20%乙醇中，4℃保存。
【實驗結果】
以各個收集管的管號為橫坐標，280nm處紫外吸收值為縱坐標作圖，得到洗脫曲線。分析實驗結果並討論。
