簡介
甲型H1N1流感病毒實驗室檢測技術方案
甲型H1N1流感病毒實驗室檢測技術方案
(試行)
本方案旨
甲型H1N1流感病毒實驗室檢測技術方案在為全國流感監測網路實驗室提供甲型H1N1流感病毒實驗室檢測技術方案，不用作商業活動或贏利目的。
一、標本的採集種類和要求
1、推薦採集的呼吸道標本種類
疾病發病後應儘快採集如下標本：鼻拭子、咽拭子、鼻腔吸取物、鼻腔沖洗液。氣管插管的病人也應收集氣管吸取物。標本應置於無菌病毒採樣液，並立即用冰塊或冰排保存或置於4 ℃ （冰櫃），並馬上送至實驗室。（臨床樣品採集人員及實驗室檢測人員的感染控制指導請見相關檔案。） 採樣同時填寫疑似人感染甲型H1N1感染病例標本採樣單。（附表1）
2、拭子的選擇
標本應使用頭部為合成纖維的拭子（例如，聚酯纖維），用鋁或塑膠做柄。不推薦棉拭子和木柄。標本採集管應包含3毫升病毒採樣液（含有蛋白質穩定劑，阻止細菌和真菌生長的抗生素，緩衝液）
3、臨床標本儲存要求
保存在4℃（不能超過4天）或者-70℃或-70℃以下。有條件的實驗室均應保存在-70℃或-70℃以下。不應保存在-20℃。
4、標本的分裝處理
標本送至實驗室後，立即進行處理，避免反覆凍融。將原始標本分為三份，一份用於核酸檢測，一份用於病毒分離，一份保存待覆核。
5、標本的運輸
疑似人感染甲型H1N1感染病例列為 A類，用UN2814包裝運輸。填寫疑似人感染甲型H1N1感染病例標本送檢單（附表2）。
二、核酸檢測
基於PCR原理的核酸檢測方法是一種快速有效的診斷方法，在突發傳染病應急工作中發揮了巨大作用。
1、基於real-time RT-PCR的方法檢測新的甲型H1N1流感病毒（引物和探針序列為美國CDC設計）：
4月29日WHO網站上公布了美國CDC設計的針對此次甲型H1N1流感病毒的real-time RT-PCR引物和探針，此實驗用於檢測疑似甲型H1N1流感病例的呼吸道樣本, 因此，用此real-time RT-PCR的方法，建議首先篩選甲型流感病毒並排除季節性流感病毒和H5N1禽流感病毒。real-time RT-PCR方法參見附屬檔案3（中文翻譯版），附屬檔案4（英文原版）。
2、基於RT-PCR的方法檢測新的甲型H1N1流感病毒（引物序列為國家流感中心設計）：
目前國家流感中心設計了RT-PCR方法檢測新的甲型H1N1流感病毒。RT-PCR的方法參見附屬檔案5。
三、病毒分離鑑定
可採用雞胚和/或MDCK細胞進行流感病毒分離。具備相應條件的網路實驗室在收到標本後24h內進行病毒接種。具體方法參見附屬檔案6和7。
四、適用於實驗室工作人員的甲型H1N1流感病毒生物安全
（一）實驗室級別及個人防護
1、對採集自屬於感染甲型H1N1流感病毒疑似病例的患者的臨床標本進行的診斷性實驗工作，在BSL-2實驗室內進行。所有樣本操作均應在生物安全櫃（BSC）內進行。遵循生物安全三級個人防護。
2、對採集自屬於感染甲型H1N1流感病毒疑似病例的患者的臨床標本進行的病毒分離培養工作，應在BSL-3實驗室內進行，並遵循生物安全三級個人防護。
（二）健康監測
1、所有人員均應自測發熱及其他症狀。
2、感染甲型H1N1流感病毒的症狀包括咳嗽、喉嚨痛、嘔吐、腹瀉、頭痛、流鼻涕和肌肉疼痛。如有不適，應立即向上級報告。
3、如有人員在無防護情況下暴露於甲型H1N1流感確診病例的臨床標本或活病毒，應考慮在暴露後的7天時間裡使用奧司他韋或扎那米韋進行抗病毒藥物預防。
五、附表和附屬檔案
附表1 疑似人感染甲型H1N1感染病例標本採樣單
附表2 疑似人感染甲型H1N1感染病例標本送檢單
附屬檔案3： real-time RT-PCR方法檢測甲型H1N1流感操作規程(2009版)（中文）
附屬檔案4： real-time RT-PCR方法檢測甲型H1N1流感操作規程(2009版)（英文）
附屬檔案5： RT-PCR方法檢測甲型流感病毒
附屬檔案6：甲型H1N1流感病毒雞胚分離方法
附屬檔案7：甲型H1N1流感病毒MDCK細胞分離方法
附表1
疑似人感染甲型H1N1流感病毒病例標本採樣單
| 姓名 | 性別 | 年齡 | 職業※ | 現住址 | 發病日期 | 標本# 種類 | 標本量 （g或ml） | 採集 日期 | 備註 |
※選項：參照傳染病報告卡。
#選項：A鼻咽拭子、 B鼻咽吸取物、C鼻腔沖洗液、D鼻腔吸取物、E氣管吸取物、F其他（如為其他，請在表格中註明）
採集人員： 採集單位（蓋章）：
附表2
疑似人感染甲型H1N1流感病毒病例標本送檢單
| 姓名 | 性別 | 年齡 | 職業※ | 現住址 | 發病日期 | 標本# 種類 | 標本量* （g或ml） | 採集 日期 | 備註 |
※選項：參照傳染病報告卡
#選項：A鼻咽拭子、 B鼻咽吸取物、C鼻腔沖洗液、D鼻腔吸取物、E氣管吸取物、F其他（如為其他，請在表格中註明）
*標本量：如果同一份標本有多個包裝請註明。
填表人員： 送樣時間： 單位（蓋章）：
附屬檔案3
real-time RT-PCR方法檢測甲型H1N1流感操作規程
中文翻譯版（請同時參考英文原版）
請注意：體系建立請參照所使用試劑盒供應商所提供的使用說明。本規程中的體系僅供參考。
美國CDC實時RTPCR(rRTPCR)檢測豬流感操作規程(2009版)
本規程所有權歸屬疾病控制中心，緊急狀態時授權各公共衛生實驗室使用。本規程不用作商業活動或贏利目的。
一、概 述
（一）前提
本規程基於對rRT-PCR方法的基本掌握。
（二）實驗原理
實時螢光定量RTPCR(rRTPCR)法檢測豬流感的方案是用一組寡核苷酸引物和雙重標記的TaqMan®探針，對呼吸道樣本或體外培養的豬流感病毒進行定性檢測鑑定。InfA引物和探針為檢測出甲型流感病毒而設計，swInfA引物和探針可特異性地檢測出所有的豬甲型流感病毒，swH1引物和探針可特異性檢測豬流感病毒H1亞型。本實驗用於檢測甲型流感陽性的疑似豬甲型流感感染病例的呼吸道樣本。
（三）使用條件
一步法定量RT-PCR 96孔板熱循環系統。
（四）生物安全要求
樣本處理應在相應的生物安全實驗室完成。
（五）樣本要求
1、呼吸道樣本
支氣管肺泡灌洗液，氣管抽吸物，痰，鼻咽或口咽洗液或拭子。拭子樣本所用的拭子頂端應為人造材質（如聚脂或滌綸）、柄為鋁製或塑膠。不推薦使用棉頭木柄的拭子。藻酸鈣拭子採樣不可取。
2、排除標準
1）未在2－4°C (≤4 天)或-70°C及以下保存的樣本
2）以上未列的其它不當樣本
（六）核酸提取
RT-PCR擴增效能依賴於樣本模板RNA的質與量。RNA提取操作需經過檢驗核酸的純度合格之後，再用於樣本實驗。商業化的操作程式中包括QIAamp® 病毒RNA提取試劑盒，RNeasy®小試劑盒 (QIAGEN公司)，羅氏MagNA Pure Compact RNA分離試劑盒, MagNA Pure LC RNA分離試劑盒II, 和羅氏MagNA總核酸純化試劑盒，在推薦的操作程式下，可提取高純度的RNA。
（七）免責聲明：提到的廠家名僅用作舉例，並不表示疾控中心認可。
二、實驗材料
（一）試劑
1、一步法螢光定量RT-PCR探針試劑盒；
2、分子級無菌蒸餾水 (無RNA酶和DNA酶)；
3、正反向引物 (40μM)；
4、雙重標記探針(10μM)；
5、陽性對照。
（二）供給
1、實驗室標記筆；
2、微量離心管格柵，96孔0.2ml PCR反應管；
3、20μl 和 200μl 可調節移液器及濾芯槍頭；
4、0.2ml PCR 反應管盤；
5、光學反應蓋板；
6、無菌,無核酸酶的1.5 ml微量離心管；
7、一次性無粉手套。
（三）儀器設備
1. 微量離心機；
2. 漩渦振盪器；
3. 實時螢光定量PCR檢測系統，含96孔的熱循環反應板。
三、操作程式
（一）準備工作
1. 避免樣品污染
由於fluorogenic 5’核酸酶測定的敏感性，應特別注意假陽性產生。推薦以下預防污染的方法：
1）實驗準備與核酸提取使用獨立區域；
2）實驗準備與核酸提取使用專用設備（如移液器，微量離心機）和耗材（如微量離心管，吸頭）；
3）實驗開始後穿清潔工作服，並使用新的一次性無粉手套；
4）不同樣本操作之間，以及懷疑可能污染的情況下均更換手套；
5）試劑和反應管的蓋子應儘量關閉。
2、儀器準備
工作檯、移液管、離心機必須清潔，用去污劑淨化，例如5%的漂白劑、“DNAzap”或者“RNase AWAY®”來減小核酸交叉污染的風險。
3、試劑準備
注意：在試驗過程中，保持所有的試劑在冰架上保持低溫。
1）引物和探針
（1）分裝好的冰凍的引物和探針進行融化（已融的探針避光2-8℃可保存多達3個月，不要對探針反覆凍融）；
（2）渦鏇振盪引物和探針；
（3）瞬時離心引物和探針，之後置於冰架上。
2）Real time RT-PCR的試劑
（1）將Master Mix和酶置於冰架上；
（2）融化2×的Reaction Mix；
（3）顛倒混合2×的Reaction Mix；
（4）瞬時離心2×的Reaction Mix和酶，置於冰架上。
4、對RT-PCR的每一步過程均進行檢測
1）每個樣品的RNA提取物通過分別的引物和探針進行檢測：InfA, swFluA, Swine H1 (swH1) 和RNaseP (RP)。RNaseP引物和探針是以人的RNaseP基因為靶基因的，因此對於人的核酸可以作為內部陽性對照。
2）對於每一個過程中包括的所有引物和探針，均設立無模板對照（NTC）和陽性模板對照（PTC）。
3）人類樣本對照（HSC）提供了次級陰性對照，以便確認核酸提取過程和試劑的完整性。
5、建立反應
反應檢測混合物充分混合後加入到96孔板中。然後在適當的實驗反應和對照中，加入水和提取的核酸或者陽性模板對照（PTC）。
1）為每一個引物和探針標記一個1.5ml的微量離心管；
2）對每一個建立的反應確定反應數（N）。考慮到NTC、PTC、HSC反應和吸量誤差，製備過量的反應混合物是必要的。具體如下：
（1）如果包括對照，樣品的數量（n）為1到14，那么N=n+1；
（2）如果包括對照，樣品的數量（n）大於15，那么N=n+2。
3）Master Mix:計算加到每個引物/探針反應混合物中的各個試劑的量。計算如下：
* 體系建立請參照所使用試劑盒供應商所提供的使用說明。
4）加入水之後，通過上下吹打混勻反應混合物，不要渦鏇振盪。
5）離心5s使混合物聚集管底，然後將管子置於冰架上；
6）準備板狀的反應管子或者96孔板，置於冰架上；
7）每一個master mix吸取20μl到每一孔中，每排按順序進行，如下圖：
實驗建立舉例：
實驗樣本舉例：
注意：在任何樣本被加入之前，應該首先加入陰性模板對照（NTC）（第1列），用來檢驗master mix中的污染。HSC應該在待測樣本之後加入（第11列），用來檢驗在樣本準備或者加入過程中的交叉污染。陽性模板對照（PTC）應該在所有樣品和陰性模板對照（NTC）之後被加入。
8）在將培養板移到核酸處理區域之前，在試驗設定區域，在反應板的第一列將NTC反應進行。如上所述。
9）吸取5μl的nuclease free water到NTC孔，將NTC孔蓋上。
10）將反應板蓋上，移到核酸處理區域。
11）將含有樣品的管子渦鏇振盪5s，瞬時離心5s；
12）將提取的核酸樣本置於冰架上；
13）如上所述，樣品應該按列加入，吸取5μl的第一種樣本到所有標記這種樣品的孔中（例如，樣本“S1”如上表格所示）。不同樣本之間需更換槍頭操作。
14）加完樣本的孔要蓋住，這將會幫助防止樣品的交叉污染，並且能夠使操作人員記錄其加樣的具體進程；
15）為了避免交叉污染，必要時更換手套；
16）對剩下的樣本，重複步驟13-15；
17）加入5μl的HSC樣品加到HSC孔中（第11列）。將HSC孔蓋蓋。
18）最後，加5μl陽性模板對照RNA到所有PTC孔中，將PTC孔蓋上。
19）如果使用8個管子的條狀板子，每一條都要做標籤標記，來指明每一個樣品的位置（不要在反應管子的頂部標記！）。瞬時離心條狀管子10－15s，然後置於冰架上。如果使用培養板，4℃，500g離心30s，置於冰架上。
6、RT-PCR擴增條件
反應體系為25ul，反應條件如下：
註：在55度這一步驟中要收集螢光信號（FAM）。
* 具體擴增條件請參照所使用試劑盒供應商所提供的使用說明。
7、解釋說明/檢驗
1）探針/引物的陰性對照反應中得到的螢光增長曲線不應該超過閾值線。如果一個或者多個引物和探針的陰性反應出現了假陽性，則樣品可能已經被污染。那么整個實驗過程是無效的，嚴格的按照步驟規則重新實驗。
2）在37個循環處或者37個循環之前，所有的臨床樣本的RP反應曲線都應該超過閾值線，這表明從人類RNase P基因擴增到足夠量的RNA，也表明了樣本質量合格。然而，可能有些樣本會由於初始臨床樣本中的細胞數量較少而無法出現陽性結果。同時，從動物/禽類體內或者經細胞培養得到的樣本，經常會RP反應沒有結果或者結果很弱。如果在所有臨床樣本中檢測RNase P都陰性，則說明：
（1）從臨床材料中對核酸的不適當的提取導致RNA的損失或者來自臨床標本的RT-PCR抑制劑的殘留污染；
（2）沒有足夠的人類細胞以備檢測；
（3）方法建立和實施不當；
（4）試劑和儀器原因。
3）在40個循環之內，HSC組中InfA，swFluA，swH1探針的螢光增長曲線不應該超過閾值線。如果任何其中任何一個流感特異性探針的增長曲線超過了閾值線，那么有以下解釋：
（1）可能由於RNA提取試劑污染。在實驗前確保RNA提取試劑無誤。
（2）RNA提取過程或建立反應加樣過程發生交叉污染。嚴格遵照操作程式的要求進行重複實驗。
（3）在40個循環之前，PTC反應的InfA, swInfA, swH1和RP反應應出現陽性結果。如果沒產生預期的陽性結果則視為無效，應嚴格遵照操作程式進行重複實驗。確定PTC反應失敗原因，訂正並記錄錯誤原因及更改方案。不再使用沒產生預期結果的PTC試劑。
（4）當所有對照都滿足要求後，如果InfA反應增長曲線與閥值線在40個循環內有交叉時，則樣本被視為A型流感病毒陽性。如果A型流感病毒反應呈陽性，那么Univ SW 和/或 SW H1也可能呈陽性。如果樣本InfA和特異亞型反應（swInfA和swH1）的反正增長曲線與閾值線在40個循環內有交叉，則視該樣本為豬流感病毒A/H1陽性。如果樣本只有InfA和一個亞型的反應陽性或只有InfA陽性，請聯繫CDC做進一步指導。
（5）在所有對照都滿足要求的前提下，如果在40個循環內，待測樣本的所有InfA反應陰性則視該樣本為陰性。
8、限制規定
1）實驗員在實際操作之前應進行操作程式和試驗結果分析的培訓，熟練掌握後方可進行試驗。
2）當樣本量不足可能會產生假陰性結果，造成的原因可能是不當的收集，運輸或處理。
3）如果反應中存在過量的DNA / RNA模板時也可能出現假陰性。如果某樣本的RP反應被抑制，則可以將提取的RNA進行2倍或更大倍數的稀釋（例如1：10或1：100）來重複試驗。
9、備註
引物和探針參見英文版P7。
附屬檔案4
real-time RT-PCR方法檢測鑑定甲型H1N1流感操作規程
（英文版）
附屬檔案5
基於RT-PCR的方法檢測新的甲型H1N1流感病毒
一、目的
對採集的可疑病例標本進行檢測，篩選甲型H1N1流感病毒並排除季節性H1N1流感病毒。
二、引物
| NIC引物 | 引物名稱 | 鹼基組成 | 目的片段大小 | 備註 |
| FluA | FluA-M-F30 | TTCTAACCGAGGTCGAAACG | 235bp | 甲型流感病毒M基因通用檢測引物 |
| FluA-M-R264 | ACAAAGCGTCTACGCTGCAG | |||
| H1HA | H1 F1147 | AAGAGCACACATAATGCCAT | 527bp | H1N1亞型檢測通用引物 |
| H1 R1673 | CCATTRGARCACATCCAG | |||
| HuH1HA | H1HA F768 | ACTACTGGACTCTGCTGGAAC | 327bp | 人季節性流感病毒H1N1亞型檢測引物 |
| H1HA R1094 | CAATGAAACCGGCAATGGCTCC | |||
| SWH1HA-1 | SW-H1 F786 | AATAACATTAGAAGCAACTGG | 153bp | 此次甲型H1N1亞型流感病毒引物 |
| SW-H1 R920 | AGGCTGGTGTTTATRGCACC | |||
| RnaseP | RnaseP F | AGA TTT GGA CCT GCG AGC G | 約80bp | 與real-time PCR中RnaseP引物一致 |
| RnaseP R | GAG CGG CTG TCT CCA CAA GT |
三、材料及儀器
1、 RNA 提取試劑盒QIAGen RNeasy Mini Kit （catalog #74104）
2、β－巰基乙醇（SIGMA β-Mercaptoethanol Lot 062K0115）
3、70%乙醇
4、RT-PCR Kit：QIAGEN One step RT-PCR Kit（catalog #210212）
5、RNasin Ribonuclease Inhibitor （Promega catalog #N2111）
6、檢測引物
7、Axygen 1.5mL離心管，貨號：MCT-150-C
8、Axygen 0.2mL PCR管，貨號：PCR-02-C
9、Axygen 10μL，100μL，200μL，1000μL帶濾芯槍頭
10、10μL，100μL，200μL，1000μL加樣器
11、可調轉速14K離心機：
12、鏇渦混合器：
13、生物安全櫃：二級生物安全櫃
14、PCR儀：
15、瓊脂糖：Biowest Agarose Distributed by Gene Tech（Shanghai）Company Limited Lot No. 101685
16、核酸染料：
17、電泳液：5×TBE電泳緩衝液 cat No. 9009032718．電泳槽、電泳儀
四、實驗步驟
（一）RNA提取
1、根據標本數量分裝RLT液：從Kit中取出RLT液，用1.5mL離心管分裝，每管500μL（在體系配製區操作）。
2、在生物安全櫃內將採樣液（鼻拭子、咽拭子、胸水等）或病毒培養物（雞胚尿囊液或細胞培養液）取100μL加入RLT液管中，充分混勻。
3、每管分別加入5μL β-巰基乙醇，混勻後依次加入600μL 70%的乙醇，充分混勻。
4、從Kit中取出帶濾柱的2mL收集管，打開包裝將其做好標記。取步驟（3）中的混合液600μL加入濾柱中，12000rpm，離心15s，棄收集管中的離心液。
5、濾柱仍放回收集管上，將步驟（3）剩餘的混合液全部吸入濾柱中，12000rpm，離心15s，棄離心液。
6、於濾柱中加入700μL Wash Buffer RW1液，12000rpm，離心15s。
7、從QIAGEN RNeasy Mini Kit中取一支幹淨的2mL收集管，將離心後的濾柱移到新的收集管上，於濾柱中加入500μL Wash Buffer RPE液，12000rpm，離心15s。
8、棄收集管中的離心液，再於濾柱中加入500μL Wash Buffer RPE液，13000~14000rpm，離心2min。
9、將濾柱移到一個乾淨的1.5mL eppendorf管上，向濾柱中加入30~50μL的Rnase-free Water，室溫靜置1~3min。
10、12000rpm，離心1min，收集離心液即為提取的病毒RNA，立即做實驗或-20℃以下保存。
注意：Buffer RPE使用之間加44mL無水乙醇。
（二）反應體系配製
1、實驗設計：
檢測標本RNA
質控參數：
陰性對照：無菌水（標本RNA提取時，跟標本同時提取無菌水。）
陽性對照：已知病毒RNA
2、PCR反應體系配製（在體系配製區配反應液）
1）按下表加入試劑：
PCR反應體系
| 組 分 | 體 積（μL） |
| RNase Free Water 5×RT-PCR Buffer | 11.9×n 5×n |
| 10mM dNTP Mixture | 1×n |
| Enzyme Mix | 1×n |
| RNase Inhibitor | 0.1×n |
| 上游引物 | 0.5×n |
| 下游引物 | 0.5×n |
| Total | 20×n |
對每一個建立的反應確定反應數（n=擬進行的PCR管數，包括陰性，陽性對）。考慮到陰性無模板對照，陽性對照，誤差，製備過量的反應混合物是必要的。具體如下：
（1）如果包括對照，樣品的數量（n）為1到14，那么N=n+1；
（2）如果包括對照，樣品的數量（n）大於15，那么N=n+2。
2）將上述反應液混勻，分裝到0.2mL PCR小管中，每管20μL，分別做好標記。
3）加RNA模板（在核酸提取區）
將上述分裝好的PCR小管分別加入模板。首先加入陰性對照管（5μL無菌水），然後分別加標本RNA（每管5μL），最後加入陽性對照RNA（每管5μL）。
3、RT-PCR反應
將上述加好模板的反應管混勻，短暫離心後放入PCR儀進行RT-PCR
擴增，反應程式如下：
| 溫度 (C) | 時間 | 循環數 |
| 60℃ | 1min | 1 |
| 42℃ | 10min | |
| 50℃ | 30min | |
| 95℃ | 15min | |
| 94℃ | 30s | 35 |
| 52℃ | 30s | |
| 72℃ | 1min | |
| 72℃ | 7min | 1 |
| 4℃ | 保存 |
4、RT-PCR產物檢測
1）2.0%瓊脂糖凝膠製備：稱取2.0g Agarose，倒入耐熱玻璃瓶內，再加入電泳液（1×TBE）100mL，輕輕混勻後加熱，使Agarose完全熔化。待Agarose膠溫度降至50～60℃左右，加入核酸染料，輕輕混勻（不要產生氣泡）。待膠溫度降至50℃左右時，將其倒入制膠板，插好電泳梳子。待膠完全凝固（約30～60min）之後，將梳子拔出。
2）將製備好的電泳膠放入電泳槽（帶梳子孔的一端在陰極），倒入電泳液（1×TBE）浸過膠面即可。
3）PCR產物各取10μL，加入2μL上樣緩衝液（6×Loading Buffer），混勻後加入電泳膠孔內（先加Marker（DL－2000）5μL，然後依次加標本PCR產物，再加陰性對照，最後加陽性對照產物）。
4）電泳電壓100V，約30～40min後看結果。
5）將電泳膠放入凝膠成像系統觀察結果並照相。
5、結果判斷
在系統成立，即陰陽性參考均正常的條件下，各引物所代表意義如下：
| PCR引物 | 待檢樣品1 | 待檢樣品2 | 待檢樣品3 | 待檢樣品4 | 待檢樣品5 | 待檢樣品6 |
| FluA | _ | + | + | + | + | +/- |
| H1HA | _ | _ | + | + | + | +/- |
| HuH1HA | _ | _ | + | _ | _ | +/- |
| SWH1HA-1 | _ | _ | _ | + | _ | +/- |
| RnaseP | + | + | + | + | + | _ |
| 結果判斷 | 非甲型流感病毒 | 甲型流感病毒 非H1N1亞型 | 人季節性H1N1亞型流感病毒 | 豬H1N1亞型流感病毒 送國家流感中心覆核 | 送國家流感中心檢測 | 標本不是人源標本/標本中細胞量少/實驗或儀器問題 |
