簡介
病原微生物也是一種重要的生物資源，它的保藏 不僅有利於重現已經做過的實驗，證實發現新的菌 ( 毒) 種，而且也是研究、推廣、開發和實際套用科研成 果的基礎。保藏的菌( 毒) 種有的是開發利用的對象， 有的是悉心研究的成果，有從自然界分離得到的，有經 生物技術修飾改造獲得的，都有著極大的研究價值和 開發利用的潛力。因此，菌( 毒) 種的保藏工作至關 重要。
病原菌保藏
1 病原菌保藏及其管理進展 為探討一種能長期保存菌種的理想方法，以便更 好地為科研、教學提供標準菌株。有人將需保存的菌 株純化後，用鮮牛奶製成常用菌懸液、高濃菌懸液，分 別分裝菌種管中置 －70 ℃超低溫快速預凍過夜，冷凍 乾燥機真空乾燥封口，－ 30 ℃保存，他們發現濃度為 106 ～107 個/ml 和510 ～1010個/ml 的菌液經15 年保存 後菌株的存活率分別為92． 3%和100%，經20 年保存 後菌株的存活率分別為61． 53%， 98． 46%。他們認為 鮮牛奶高濃菌懸液冷凍真空乾燥可長期保存各種微生 物菌種[3]。也有人採用 8 種不同的菌種保藏方法，對 18 種常見病原菌的保藏時間及生物學特性的影響進 行了對比觀察。結果表明，冷凍乾燥法保藏菌種時間 最長( 該實驗室已保存 15 年) ，肉浸液瓊脂平板法保 藏菌種時間最短( 2 ～ 3 月) 。保藏時間由長到短依次 為冷凍乾燥法 >半固體冷藏法≥半固體斜面加液體石 蠟覆蓋法 >半固體斜面法 >肉浸液加液體石蠟覆蓋法 >血瓊脂平板法 >肉浸液法 > 肉浸液瓊脂平板法，而 且相同方法對不同菌種保藏時間不同。保藏時間在 1 年以內的菌種，其生物學特性無明顯變異，而經冷凍乾 燥法保藏時間較長的白喉棒狀桿菌、金黃色葡萄球菌、 甲型及乙型副傷寒沙門氏菌的生物學特性有不同程度 改變[4]。為探討醫學微生物實驗室常用菌( 毒) 種的 保存方法和安全管理措施，又有人根據細菌的特性及 營養要求，選擇適宜的培養基和培養方法，經生物學鑒 定合格的菌種，根據需要選擇適當的方法保存，並指定專人負責保管和制定菌( 毒) 種安全管理制度。運行過 程他們發現，不同方法保存的菌( 毒) 種，保存時間不 一樣。他們認為，實驗室可根據實際需要選擇最佳的 保存法，指定專人保管菌( 毒) 種並制定安全管理制 度，保證菌( 毒) 種質量和安全[5]。微生物菌( 毒) 種是 國家重要的生物資源和戰略資源，與生物安全、人類健 康、環境保護和可再生能源等密切相關。醫學病原微 生物是微生物學的重要組成部分，是能夠引起人類各 種疾病的致病性微生物。在實驗室生物安全日益得到 廣泛關注的形勢下，病原微生物菌( 毒) 種作為實驗室 生物安全管理工作的核心內容，做好保藏管理尤為重 要。研究者根據新形勢下我國實驗室生物安全管理工 作的需要，綜述了菌( 毒) 種保藏管理有關規範及要 求[6]。這也是我國 2003 年非典防控以來微生物實驗 室生物安全重要舉措的理論基礎。
消化道病原菌
2 消化道病原菌保藏進展 有人為了探索一種簡便、實用並能長期保存小腸 結腸炎耶爾森菌菌種的方法，他們於1988 年將小腸結 腸炎耶爾森菌菌種( 血清 O:3 型和血清 O: 9 型) 接種 於雞蛋斜面培養基及半固體培養基復甦後加滅菌液體 石蠟，置 －4 ℃普通冰櫃保存，且每年進行復甦鑑定。 結果 O:3 型菌種可保存 21 年， O:9 型保存 22 年以上 依然存活。他們的體會是雞蛋斜面保存法和半固體穿 刺法 －4 ℃保存小腸結腸炎耶爾森菌菌種效果良好， 可長時間保存，且不需要反覆傳代[7]。又有人[8]為探 索一種簡便、有效的彎曲菌菌種保存方法。他們採用 含30%甘油的腦心浸液肉湯，將實驗室保存的19 株 彎曲菌於 －30 ℃和 －70 ℃分別保存，每個菌株3 個菌 種管， 1 年後採用 5% 脫纖維羊血的布氏肉湯進行增菌，然後轉種哥倫比亞血平扳，比較存活效果。結果顯 示，－30 ℃條件下採用多管法保存彎曲菌可以獲得與 －70 ℃條件下保存相當的效果。這些研究者認為采 用多管法( 每株菌3 個菌種管) 於 － 30 ℃冷凍保存彎 曲茵是一個簡單、方便、有效、實用的方法。針對能夠 較長時間地保存志賀菌的培養基鮮有報導，有人研究 出了一種在斜面上能夠較長時間保存沙門氏菌和志賀 氏菌等腸桿菌科細菌的培養基[9]。有人對增菌培養基開展研究，他們設計出一種能同時富集培養沙門氏 菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的緩衝鹽水肉湯 ( buffed salinebroth， BSB) ，主要組分和含量為蛋白腖 10 g、牛肉膏3 g、磷酸氫二鈉9 g、磷酸二氫鉀1． 5 g、添 加劑50 g，蒸餾水定容至 1 000ml， pH7． 2，將 1 cfu/ml 的上述 3 種菌同時分別接種到97 ml BSB、蛋白緩衝 水、乳糖肉湯、營養肉湯、大腸桿菌肉湯、氯化鎂孔雀綠 增菌液、 7． 5% 氯化鈉肉湯增菌培養基中， 37 ℃ 增菌 18h。結果表明， BSB 能使這3 種菌以相對一致的速度 增殖，分別達到106、 106、 107 cfu/ml，並且多重 PCR 能 同時分別擴增沙門氏菌 invA 基因 284bp、大腸桿菌 phoA 基因 622bp 和金黃色葡萄球菌 nuc 基因 484bp 的特異性條帶。相反，其他幾種培養基則不能同時協 調增殖上述 3 種菌。他們認為 BSB 有較好的套用前 景[10]。還有人[11]為探索高效的幽門螺桿菌培養和保 存方法，採用空腸彎曲菌瓊脂加混合抗生素的馬血清， 在微需氧條件下， 37 ℃培養 2 ～ 3 d，成功培養出幽門 螺桿菌，且增菌迅速;他們的結論是採用固體培養和保 存液低溫液氮保存，能夠較好保存且復甦率高。針對 空腸彎曲菌培養條件苛刻，菌株不易保存這一難題，有 人用7 種通常用於空腸彎曲菌保存的方法，進行了詳 細的比較和研究，結果表明溫度在 －70 ℃適合於菌株 的長期保存，溫度在 2 ～8 ℃保存時間較短，但操作簡 便，適用於菌株的暫時保存[12]。
呼吸道病原菌
3 呼吸道病原菌保藏進展 流感嗜血桿菌( Hin) 是幼兒腦膜炎、菌血症、膿毒 性關節炎、肺炎、氣管支氣管炎、中耳炎、結膜炎、鼻竇 炎和急性會厭炎的主要病原菌。而在流感的病原微生 物檢驗工作中，成功進行細菌菌種保存，對於研究細菌 的生物學特徵、探討耐藥性變異的機理、監測醫院感染 病原流行趨勢以及開發新藥等至關重要。某教研室嘗 試了4 種流感嗜血桿菌的保存方法，其中包括甘油血 清肉湯法、脫脂牛乳法、紙片法和真空冷凍乾燥法，保 存1 個月、 3 個月、 6 個月、 1 年後將菌種復甦進行比 較，試圖從中找到一個最佳的保存方法，通過對比實 驗，研究者建議把脫脂牛乳法作為菌種保存的推廣方 法，因為其既可以短期保存苛氧菌，也應該可以用於其 它細菌的保存，他們正在進一步觀察其他臨床標本保 存於以上 4 種方法的實用性和穩定性[13]。同期有 人[14]報告採用脫脂牛奶和脫纖維羊血兩種方法保存 流感嗜血桿菌菌種，認為存活力較好，不需特殊設備， 至少可存活3 個月以上，方法簡單、可行。但該方法是 否可廣泛套用於其他苛養菌的菌種保存，以及保存期 限可否更長，有待進一步的研究。
接觸傳播病原菌
4 接觸傳播病原菌及病原真菌保藏進展 淋球菌等奈瑟氏菌體外嬌嫩難以保存，如何簡單 而又可靠地長期保存淋球菌，一直是科研工作者關心 的課題。有研究者對目前幾種保存淋球菌的方法進行 比較，鮮奶法、脫纖維血法、普通奶粉法和冷凍真空乾 燥法4 種方法同時保存 85 株淋球菌。結果冷凍真空 乾燥法1 年和2 年內復甦，復活率均為 100%; 鮮奶法 1 年內復甦，復活率為 100%， 2 年內復甦，復活率為 97． 7%，脫纖維血法1 年內復甦，復活率為 100%， 2 年 內復甦，復活率為82． 3%。上述 3 種方法明顯高於普 通奶粉法組( 9． 4%， 1． 2%) ，差異具有顯著性( P <0． 01) 。他們認為鮮奶法保存淋球菌具有經濟、簡便實 用、存活率高等優點，是一種較理想的貯存淋球菌的方 法，短期( 1 年內) 脫纖維血法也是一種較理想的貯存 淋球菌的方法[15]。有人用 3 種淋球菌菌種保存方法 進行了比較[16]，他們的體會是冷凍真空乾燥法保存淋 球菌，雖然可靠，但操作繁瑣費時，需要貴重儀器 － 冰 凍乾燥機和真空泵等，成本較高。鮮奶法和普通奶粉 法，－70 ℃冰櫃保存，存活率分別為 100%和 98%，此 兩種方法操作簡單易行，經濟實用，保存細菌存活率 高，在基層實驗室有較高推廣價值。巴爾通體、立克次 氏體等菌株體外均難以保存與復甦。有人探索巴爾通 體菌株保存和復甦的方法及其條件，他們套用傳代持 續培養保存法和冷凍保藏法對所保存菌株進行實驗， 並對冷凍保藏後的菌種進行復甦試驗。結果兩種方法 能較好地保存巴爾通體菌株，復甦後生長良好，他們認 為兩種方法保存菌種是可行的，巴爾通體菌株對冷凍 和反覆凍融有很強的抵抗力。顯微鏡凝集試驗是 確診鉤端螺旋體病的重要血清學方法，但要保存一套 標準菌株作抗原並非易事，有人對 3 種不同鉤體菌種 保存方法進行了比較，認為實驗結果理想[18]。 有人觀察了在低溫真空冷凍乾燥長期保存的真菌 菌種存活情況，皮膚癬菌存活率為 91． 6%，大部分菌 種存活至20 年;酵母樣菌存活率為 83． 5%，最長存活 22 年; 深部真菌存活率為83． 4%，除個別菌種外多數 菌種均存活22 年;腐生菌存活率為 75%，其中麴黴菌 屬保存至22 年全部存活。研究者發現他們的絕大部 分真菌菌種用冷乾法保存，可存活13 ～22 年[19]。
藥品檢定菌種保藏
5 藥品檢定菌種保藏進展 藥品、生物製品檢驗用的標準菌株的保藏和使用 至關重要，必須確保相關實驗的準確性、重現性和穩定 性。有人指出[20]在保藏過程中，必須使微生物的代謝 處於最不活躍或相對靜止的狀態，才能在一定的時間 內使其不發生變異而又保持生活能力。低溫、乾燥和隔絕空氣是使微生物代謝能力降低的重要因素，所以， 菌種保藏方法雖多，但都是根據這三個因素而設計的。 還有人比較了幾種菌種保藏方法後認為應根據試驗需 要與條件選擇最適宜的菌種保藏方法[21]。《中國藥 典》 ( 2005 年版) 要求對藥品的無菌檢查和微生物限度 檢查時進行方法學驗證，無菌檢查用培養基的靈敏度 檢測所用的試驗菌種的菌齡不得超過5 代。即便如 此，有人還認為採用一種適宜的保藏方法來保藏菌種， 避免在保藏期間和傳代過程中的死亡，變異，衰退，以 保持菌種原有的各種生物學特性，方能達到保證研究、 檢驗正確使用菌種的目的[22]。
疫苗保藏
6 疫苗保藏材料研究進展 成品疫苗中的殘餘水分對疫苗的保藏以及免疫效 果有嚴重影響。而影響凍乾製品殘餘水分的因素很 多，但西林瓶膠塞的含水量是其關鍵因素。有人使用 經乾烤工藝處理和未乾烤處理的藥用溴丁基膠塞進行 麻疹減毒活疫苗凍乾試驗，結果顯示，用未經乾烤工藝 處理及處理的藥用溴丁基膠塞凍乾的麻疹減毒活疫 苗，存儲18 個月後，水分上升的平均值分別為2． 03% 和0． 08%，經單一因素的方差分析，兩者有統計學意 義( P <0． 01) ，研究結果證明，經處理的藥用溴丁基 膠塞，對保持麻疹減毒活疫苗在存儲期內的殘餘水分 穩定作用效果明顯[23]。 病原微生物的保藏與醫學研究、教學、以及國計民 生關係密切。十一五期間的相關網路資料顯示，我國 在呼吸道、消化道、接觸傳播和藥品檢定用病原菌、毒 種保藏以及菌、毒種保藏管理等方面均有一定進展 。
