桿菌介紹
腸出血性大腸桿菌（EHEC）是能引起人的出血性腹瀉和腸炎的一群大腸埃希氏菌。以O157:H7血清型為代表菌株。
生物學特徵
1、EHECO157:H7屬於腸桿菌科埃希氏菌屬。革蘭氏染色陰性，無芽胞，有鞭毛，動力試驗呈陽性。其鞭毛抗原可丟失，動力試驗陰性。。
2、EHECO157:H7具有較強的耐酸性，pH2.5-3.0，37℃可耐受5小時；
3、耐低溫，能在冰櫃內長期生存；在自然界的水中可存活數周至數月；
4、不耐熱，75℃1分鐘即被滅活；對氯敏感，被1mg/L的余氯濃度殺滅。
5、EHEC的最適生長溫度為33-42℃，37℃繁殖迅速，44-45℃生長不良，45.5℃停止生長。
6、EHECO157:H7除不發酵或遲緩發酵山梨醇外，其他常見的生化特徵與大腸埃希氏菌基本相似，但也有某些生化反應不完全一致，具有鑑別意義。EHECO157:H7雖然有uidA基因，但其編碼的β-葡萄糖醛酸酶無活性，不能分解4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷（MUG）產生螢光，即MUG陰性。
7、EHEC除其代表菌株O157:H7外，還包括O157:NM、O26:H11、O111:H8、O125:NM、O121:H19、O45:H2、O4:NM、O145:NM、O5:NM、O91:H21、O103:H2、O113:H2等血清型的部分菌株。血清學鑑定包括O抗原和H抗原的鑑定。前者可使用玻片凝集試驗或膠乳凝集試驗；後者則應先進行動力試驗，動力活潑者再進行玻片和試管凝集試驗。
8、EHECO157:H7的另一個顯著特徵是可產生大量的Vero毒素（VT），也稱作類志賀氏毒素（SLT），是EHEC的主要致病因子。Vero毒素按免疫原性等方面的不同可分為VT1和VT2。該毒素有一個A亞單位和5~6個B亞單位組成。B亞單位與宿主腸壁細胞糖脂受體結合，具有毒素活性的A亞單位進入細胞，改變60s核糖體的組分，干擾蛋白質的合成。編碼VT的基因位於噬菌體上，可缺失而不產生VT。
流行病學
3.1流行概況
美國俄勒崗州和密執安州，因食用漢堡包引起的食物中毒的病人糞便中被分離並命名的。據美國疾病控制中心(CDC)報告，每年全國約發現2萬多例病人。死亡人數200-500人，以後陸續在全球五大州20多個國家被發現或引起暴發和流行。自82年發現至今，發生規模最大的一次爆發是97年5月下旬，日本岡山、廣島等縣幾十所中學和幼稚園相繼發生6起集體食物中毒事件，人數多達1600人，導致3名兒童死亡，住院兒童達80人。同時日本仙台和鹿兒島形成中毒人數過萬人，死亡11人，波及44個都府縣的爆發性食物中毒，引起全世界的關注。此外美國、加拿大、瑞典、澳大利亞、蘇格蘭、威爾斯等國家和地區也相繼報導了EHEC的散發性感染和暴發流行。
我國1988年首次分離到E.coli O157:H7。從已有的流行病學調查資料看，我國也存在散發病例，還沒有爆發流行的報導。近幾年也通過監測，先後從牛、豬、羊、糞便，肉類等食品中查到E.coliO157:H7。
2011年5月26日，德國明斯特大學醫院26日宣布，該院衛生研究所經調查確認，近日在德國暴發的腸出血性大腸桿菌（EHEC）疫情是由一種名為“Husec41”的腸出血性大腸桿菌變種引起。這一少見的變種對很多抗生素具有抗藥性。與此同時，德國漢堡衛生研究所已查明這種病菌的一個來源是產自西班牙的黃瓜。
3.2流行特點
1.季節性：多發生於夏秋兩季6-9月為發病高峰。11月至次年2月極少發病。
2.地區分布：多發生於已開發國家，主要以散發性為主。
3.易感人群：兒童5-9歲、老人50-59歲明顯高於其它年齡組，最小3個月，最大85歲。
4.宿主：農場動物牛、羊、豬、雞、馬、鹿、鴿子、海鷗等均可能為大腸桿菌
O157的攜帶者。
5.食源性E.coliO157:H7感染：牛肉、生奶、雞肉及其製品，蔬菜、水果及製品等均可引起污染，其中牛肉是最主要的傳播載體。
致病性
4.1致病因素
毒素（VT），也稱作類志賀氏毒素（SLT），是EHEC的主要致病因子。Vero毒素按免疫原性等方面的不同可分為VT1和VT2。該毒素有一個A亞單位和5~6個B亞單位組成。B亞單位與宿主腸壁細胞糖脂受體結合，具有毒素活性的A亞單位進入細胞，改變60s核糖體的組分，干擾蛋白質的合成。編碼VT的基因位於噬菌體上，可缺失而不產生VT。
4.2所致疾病
(2)出血性結腸炎(HC)
(3)溶血性尿毒綜合症(HUS)
(4)血栓性血小板減少性紫癜(TTP)
E.coliO157:H7的感染劑量極低。伏期為3-10天，病程2-9天。通常是突然發生劇烈腹痛和水樣腹瀉，數天后出現出血性腹瀉，可發熱或不發熱。部分患者可發展為HUS、TTP等，嚴重者可導致死亡。
檢驗方法
(一)國標法（常規法）
1、增菌培養
2、分離
3、鑑定
(二)金標試紙法
該方法是中華人民共和國衛生部頻布的“關於全國腸出血性大腸桿菌O157：H7感染性腹瀉應急處理預案”中的指定方法。
將樣品經過特殊的前增菌及增菌後，取120ul的增菌培養液放入試紙夾的樣品槽中，樣品由於毛細管作用移至反應區，反應區中含有特殊的抗體(E.coliO157:H7抗體)它與膠體金顆粒共軛偶聯。如果樣品中存在抗原，將同金標抗體結合形成抗原-抗體複合物，沿著硝酸纖維素膜向前移動至含有固定的抗E.coliO157:H7抗體區域(T區)，金標免疫的複合物與該區域的抗抗體發生特異性結合形成一條可見的線。其它的樣品繼續移動到膜的未端，最終進入廢物池被遺棄。
反應區也含有金標結合的一種專利抗原(顏色指示劑)，不管樣品中有沒有E.coliO157:H7抗原，它都被樣品洗脫。金標控制指示劑通過膜移動到陰性控制區與專利抗體結合形成一條可見的線。無論樣品中有沒有E.coliO157:H7抗原，控制線都將在控制區(C區)形成，來確保試驗正常進行。
增菌液滴入8-10分鐘後，觀察試紙C區和T區有無明顯的線。在C和T區都有可見的線，則結果為陽性。C區有線、T區無線，則結果為陰性。如C區無線，無論T區有沒有線，則實驗無效。
（三)ISO－GRID檢測系統
ISO－GRID檢測系統是一種基於疏水性網膜（HGMF）的過濾系統。該系統通過使用這種含有1600個小方格的濾膜，來對微生物進行檢測或計數。
首先，稀釋的樣品通過5um的不鏽鋼預過濾器過濾，過濾掉可能引起微生物分析誤差的樣品殘渣顆粒。
然後，樣品通過流水的濾膜過濾。再將濾膜放在特異性的瓊脂培養板上培養，以檢測目標微生物。培養完成後，在膜上檢測目標微生物，並記錄陽性區域的數量。
濾膜不會染上瓊脂培養基的顏色，從而很容易地區別微生物，並進行鑑別和記數。此方法快速簡便，重複性好，而且，除大腸桿菌O157﹕H7外，還適用於沙門氏菌、酵母、黴菌、大腸菌群及大腸桿菌的檢測和計數。
(四)單克隆酶聯免疫分析篩選方法
該方法是對所有食品E.coliO157:H7的存在進行篩選，不是確證試驗，因為試驗中所用的單克隆抗體可能與少部分的非E.coliO157:H7有交叉反應。
陽性的檢疫結果應是客觀的，必須配有450nm濾光片的光度計來進行測試。只有當陰性和陽性對照均有可接受的光密度讀數時，陽性結果才是有效的。
原理E.coliO157:H7原的檢測是基於用特異性單克隆抗體進行的酶免疫分析(EIA)。用抗E.coliO157:H7抗原的單克隆抗體包被於聚苯乙烯微量小孔的內表面，將樣品和對照加入小孔中。樣品中如有E.coliO157:H7抗原存在，則將被吸附在孔上的特異性抗體吸收。沖洗後，加入結合劑與被抗體吸收的E.coliO157:H7抗原結合。再沖洗小孔，除去未結合的結合劑，然後再加入酶底物。當用終止液終止反應時，出現的藍色則轉變為黃色。樣品中是否有E.coliO157:H7抗原取決於顏色產生的光密度。
(五)自動酶聯螢光免疫檢測系統（VIDAS）篩選法
此E.coliO157:H7的抗原鑑別是基於在VIDAS儀器內進行的酶聯螢光免疫分析。像吸液管的裝置是固相容器（SPR），在分析中既作為固相也作為吸液器。SPR包被有高特異的單克隆抗體混合物。將一定量的增菌肉湯加入試劑條，肉湯中的混合物在特定時間內循環於SPR內外。如果有E.coliO157:H7抗原存在則與包被在SPR內的單克隆抗體結合，其他沒有結合上的化合物被沖洗掉。結合有鹼性磷酸酶的抗體在SPR內外循環與結合在SPR內壁上的E.coliO157:H7抗原結合，最後的沖洗步驟將沒有結合的接合劑沖洗掉。底物—4-甲基傘形磷酸酮被SPR壁上的酶轉換成螢光產物—4-甲基傘形酮。螢光強度由光學掃描器測定。實驗結果由計算機自動分析，產生基於螢光測試的試驗值與標準相比較後列印出每一個被測樣品的陽性或陰性結果報告。
(六)E.coliO157:H7快速酶觸反應顯色培養基法
快速酶觸反應是根據細菌在其生長繁殖過程中可合成和釋放某些特異性的酶，按酶的特性，選用相應的底物和指示劑，將它們配製在相關的培養基中。根據細菌反應後出現的明顯的顏色變化，確定待分離的可疑菌株，反應的測定結果有助於細菌的快速診斷。這種技術將傳統的細菌分離與生化反應有機的結合起來，並使得檢測結果直觀，成為今後微生物檢測發展的一個重要發展方向。
(七)DNA探針技術
DNA探針技術是最新發展起來的一項特異、靈敏、快速的檢測方法，但因有一定比例的假陽性反應，故所有陽性結果必須用標準的培養方法加以確證，
原理用特異性的DNA探針進行E.coliO157:H7核糖體RNA（rRNA）的檢測。待檢樣品經前增菌、選擇性增菌和後增菌後，溶解細菌。加入標記好的E.coliO157:H7異性的DNA探針用於液相雜交。如果待檢樣品中存有E.coliO157:H7的rRNA，螢光素標記的檢測探針和多聚脫氧腺嘌呤核苷酸(polydeoxyadenylicacid,polydA)末端捕獲探針將與目標rRNA序列進行雜交。然後把包被有多聚脫氧胸腺嘧啶核苷酸(polydeoxyadenylicacid,polydT)(固相)的測桿插入雜交溶液。PolydA和poldT之間進行鹼基配對，便於探針捕獲：目標雜種核酸分子結合在固體載體上，未接合的探針被沖洗掉。測桿被培養在辣根過氧化物酶-抗螢光素接合劑中。接合劑與存在於雜交檢測探針上的螢光素標記物結合，未結合的劑被衝掉。並將測桿培養於酶底物-色原溶液中，辣根過氧化物酶與酶底物反應，將色原轉變為藍色化合物。一旦遇酸反應便停止，色原的顏色變為黃色。在450nm處測量吸收值，吸收值大於臨界則表明在待檢的樣品中存有E.coliO157:H7。
(八)聚合酶鏈反應(PCR)技術
PCR技術原理為提高DNA探針的敏感性，可先將靶DNA序列擴增，增加DNA數量，使其達到足夠的檢測量，若反應以動力學為基礎，則能定量分析。1983年Millus和Cetus發明了最基本的擴增DNA或增加樣品中特殊核苷酸片段數量的方法-聚合酶鏈反應即PCR法。PCR法建立在三步重複發生反應的基礎上。①通過熱處理將雙股DNA變性裂解成單股DNA；②退火延伸引物至特異性寡核苷酸上；③酶促延伸引物與DNA配對合成模板，引物退火，變性DNA片段，引物雜交形成的模板可參與再次反應。溶液中核苷酸通過酶聚合成相互補對的DNA片段，並能重新裂解成單股DNA成為下次PCR複製的模板。因此每次循環特異性DNA將以雙倍量增加。典型擴增經過20～40次循環能引起100萬倍的擴增。在PCR反應中引人Taq聚合酶使反應得以半自動化和簡便反應程式。用擴增DNA進行的PCR反應具有無與倫比的優越性。
