基因靶技術

基因靶技術（gen 逆轉錄病毒載體-包裝細胞系基因轉移系統是目前基因治療中最有效的基因轉移方法。 採用基因靶技術則可提高逆轉錄病毒載體的滴度，包括逆轉錄病毒載體本身的改建和包裝細胞系的改建兩個方面。

基因靶技術（gene targeting）
一、基因靶技術的原理
基因靶技術的原理是設計一個靶載體，其內含有與靶位點相同的核苷酸序列，用基因轉移的方法將載體導入靶細胞，通過載體與靶位點相同的核苷酸順序間的同源重組，使外源DNA序列定點整合入靶位點，從而達到對靶位點進行定點修復或定點突變的目的。載體分兩種：一是序列插入型載體，通過與靶點序列的單交換導入外源序列；二是序列取代型載體，通過與靶點序列間的雙交換，用外源序列取代靶序列。
二、基因靶技術的作用
（一）確定基因表達水平
目前套用最多的基因轉移途徑—逆轉錄病毒載體介導的基因轉移存在二個問題，一是導入的外源基因難以生理方式進行表達；二是即使表達也不夠完善。採用基因同源重組的基因靶技術，可使病變的基因在原位得到改正，與正常基因的結構與調控環境一致，即以生理方式來進行表達。1989年Thomphon採用小鼠胚幹細胞HPRT基因的同源重組置換，使HPRT缺陷功能得到恢復。
（二）增強基因表達的穩定性與安全性
通過逆轉錄病毒載體，將目的基因導入靶細胞後，隨時間的推移，目的基因表達的穩定性會有所下降，表達的活性會慢慢的降低，有的甚至完全停止表達。同樣，外源基因與靶細胞染色體基因組的整合位點是隨機的，常可導致基因的丟失和重排而失去表達活性。採用基因靶技術則可避免上述二種情況的發生，防止逆轉錄病毒載體的回覆突變成致病性的野生型病毒、原癌基因的激活、正常功能基因的插入失活等，從而增加基因轉移的安全性和穩定性。
（三）提高逆轉錄病毒載體的滴度
逆轉錄病毒載體-包裝細胞系基因轉移系統是目前基因治療中最有效的基因轉移方法。但是包裝細胞系培養上清液中重組逆轉錄病毒載體的滴度相對較低，是影響基因轉移效率的一個重要因素。採用基因靶技術則可提高逆轉錄病毒載體的滴度，包括逆轉錄病毒載體本身的改建和包裝細胞系的改建兩個方面。Armentano等將gag基因進行不完全缺失，保留421個鹼基，這一改建，不僅保證逆轉錄病毒載體(N2)的安全性，同時也將其滴度提高了10~40倍。Gelinas將β-球蛋白啟動子序列缺失，使逆轉錄病毒載體的滴度提高了10倍。在細胞包裝系改建方面，Anderson等研究了包裝細胞其組織、種屬來源對滴度的影響。鑒於目前基因治療中套用的逆轉錄病毒載體，大部分是由molv改建的，因此，其包裝細胞系也常採用PA317等小鼠成纖維細胞系，一般都被產出105~107cfv/ml的病毒滴度，完全能夠滿足基因治療的需要。
三、基因靶技術在基因治療中的套用
靶技術在基因治療中的套用主要包括三個方面：①基因分解，即利用靶技術將外源基因定點導入靶細胞染色體基因組的某一位點，使基因打斷，此方法又稱為基因插入突變；②基因增加，即將外源基因導入靶基因染色體上精確位點，使基因表達的蛋白，具有外源基因和內源基因共同決定的融合蛋白的性質；③基因修正，即將外源基因導入靶細胞內，糾正突變的基因。基因靶技術不僅在腫瘤的基因治療中套用，也可用於癌基因的研究，如利用基因靶技術，對癌基因或原癌基因進行定點突變，從而觀察基因突變引起細胞惡性病變的機制。