分子生物學技術[研究動植物的一種技術]

隨著生命科學和化學的不斷發展，人們對生物體的認知已經逐漸深入到微觀水平。從單個的生物體到器官到組織到細胞，再從細胞結構到核酸和蛋白的分子水平，人們意識到可以通過檢測分子水平的線性結構（如核酸序列），來橫向比較不同物種，同物種不同個體，同個體不同細胞或不同生理（病理）狀態的差異。這就為生物學和醫學的各個領域，提供了一個強有力的技術平台。

分類

目前，常用的分子生物學技術有如下幾種 ：

PCR單鏈構象多態性分析

PCR- 單鏈構象多態性分析(PCR- single strand conformation analysis,PCR- SSCP) 是近年來在基因突變檢測中運用最廣泛的方法之一。PCR- SSCP 技術憑藉突變可引起單鏈DNA三級構象改變,通過觀察單鏈DNA在非變性聚丙烯醯胺凝膠中的遷移率漂移來判斷突變。樣品經PCR 擴增後，其產物經變性後可以產生2 條單鏈，如果存在基因突變，哪怕是一個鹼基的異常，單鏈的構象也會發生變化，正常與突變的DNA單鏈在聚丙烯醯胺凝膠電泳(PAGE) 中，可以顯現出不同的帶型，從而確定野生型和突變型，PCR- SSCP 分析的主要優點是簡易且敏感性較高。但是該技術不能確定突變的部位和性質。PCR- SSCP 突變檢測敏感性隨PCR 產物長度的增加而降低，一般用於檢測較小外顯子的突變。有時由於單個核苷酸變化所引起的構象改變很小，用PAGE 電泳就可能無法檢出，在PCR 產物或待測DNA 小於200 bp 時，PCR- SSCP 分析能夠檢測出70%~ 95%的突變。如果以毛細管電泳代替PAGE，則可大為提高突變檢測的效率。

Wallace1997 年提出將PCR- SSCP 和異源DNA雙鏈分析（heteroduplex analysis,HA) 相結合，稱之為SSCP/ HA，部分PCR 產物經變性進行SSCP 分析以了解是否具有突變，其餘PCR 產物直接用於電泳，以檢出含有突變的異源DNA雙鏈，電泳凝膠經銀染，單鏈DNA所形成的帶為橘黃或棕色，而雙鏈DNA則表現為灰黑色。該綜合手段可以單鏈構型多態性和異源雙鏈構型分析兩個不同的層次檢出突變，是一種經濟、迅速的突變檢測手段，但無法提供突變位置的信息。

PCR- SSCP 有許多改進技術，如RNA單鏈構象多態性法（PCR- rSSCP）、雙脫氧測序單鏈片段構象多態分析（PCR- ddF）、限制酶指紋技術(PCR- REF) 等。PCR- rSSCP 法依據RNA構象對單個鹼基替代更敏感的原理，在PCR 引物上加上某類啟動子，通過轉錄的RNA構象體的電泳遷移差異進行突變鑑別。PCR- ddF 法把PCR 產物轉錄，將轉錄物用反轉錄酶進行Sanger 雙脫氧終止測序反應，通過觀察非變性膠上經解鏈處理所產生的單鏈漂移、突變後終止片段的獲得與缺失來判斷突變。PCR- REF 法將RFLP 和SSCP 技術優勢組合，將PCR 擴增的待測片段用5~ 6 種限制酶依次消化，混合併進行末端標記，最後經變性處理並在非變性凝膠上電泳分離，從而獲得來自片段長度和片段構象的雙重突變信息。

變性梯度凝膠電泳

變性梯度凝膠電泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE) 利用由鹼基序列所決定的DNA片段溶解度或變性度的差異，達到分離野生型與突變型DNA片段的目的，該手段解析度達一個鹼基。當DNA 雙鏈沿變性劑濃度梯度增加的聚丙烯醯胺凝膠遷移時，DNA分子中解鏈溫度（Tm) 低的部分逐漸變性解鏈。一般總是錯配鹼基部分的異源雙鏈Tm最低，最容易解鏈，其次是富含AT 鹼基對的部位，富含GC鹼基對的部位Tm值較高所以解鏈較難。因此，正常DNA雙鏈和異源雙鏈在梯度變性膠中電泳時，異源雙鏈總是先解鏈。將PCR 產生的雙鏈DNA在濃度遞增的尿素和甲醯胺變性聚丙烯醯胺凝膠上電泳，當某一DNA片段遷移到變性劑濃度與其最低Tm相當的位置時，該片段低溫解鏈部分的雙鏈打開，部分解鏈導致DNA遷移速度明顯下降，觀察樣品的遷移率變化即可判斷是否存在變異。DGGE 敏感性高，即便異源雙鏈中僅含一個錯配鹼基，在電泳時也可分辨其遷移率的改變。DGGE 方法的單鹼基突變檢出率在DNA片段長度600 bp 以內可以達到95%。

DGGE 的成功有賴於雙鏈DNA內部低溫解鏈部分變性後遷移率的改變。但在相當於最高Tm的變性劑濃度的位置，相應的DNA片段可能全部解鏈，使試驗無法檢出存在於高Tm DNA片段中的鹼基替換。為了解決此問題，可以在一個PCR 引物的5 ' 端設計一段富含GC的尾巴，從而使PCR 擴增產物的一端富含GC 鹼基對，保證了絕大多數DNA片段不會發生完全解鏈，在最高變性劑濃度區域仍然可以分辨出部分解鏈的異源雙鏈，這一改進使DGGE 的突變檢出率接近100%，但DGGE 只能檢測突變是否存在而不能確定突變的位置。

DGGE 方法需要設計特定片段最佳的PCR引物以及最佳變性條件，這一過程比較複雜，梯度變性膠的製備需要的設備較昂貴，所以在常規實驗室不易實施。

雙鏈構象多態分析法

雙鏈構象多態分析（double- strand conformation analysis,DSCA) 是利用螢光標記引物，通過PCR 擴增出相關的研究片段作為螢光標記參照（fluorescence labeled reference,FLR)DNA分子。然後，用標記參照物FLR 分子與待測PCR擴增片段進行雜交。因為FLR 和樣本核苷酸序列相似，雜交反應液中所有DNA的正鏈和反義鏈之間將形成雙鏈結構。只有與帶螢光標記的FLR 分子正鏈匹配的DNA雙鏈，經過電泳後方可被DNA測序儀的雷射檢測系統所檢測。所以，可檢雙鏈均有一樣的FLR 正鏈，雜交雙鏈的電泳遷移率可能相同，但是由於反義單鏈的差異雙鏈變性程度的差異而最終造成電泳遷移率的不同。不像SSCP 技術，DSCA能夠任意操縱變性雙鏈的形成，選用不同的FLR可以達到難分樣本的最佳分離效果。另外，通過調整FLR 和樣本待測DNA分子的比例，可專一性增強雜交異質雙鏈信號並減弱純合雙鏈信號。DSCA技術的優點還在於它依據樣品經過固定檢測儀的時間差，而非相同電泳時間遷移的距離差來判斷突變的有無，這樣就避免了諸如SSCP 等技術分析中因遷移速率差異而降低的泳動速度慢的條帶檢測率。另一方面，DSCA的有效檢測片段長度可達1 kb。由於雷射系統的介入，DSCA的靈敏度和上樣量分別得以提高和降低，不到1 秒的泳動差異也足以檢測。該技術已被成功地用於囊性纖維化基因（cystic fibrosis gene) 的4 種突變，以及HLA Ñ型基因中131 種等應基因的檢測。

變性- 高壓液相色譜分析

變性- 高壓液相色譜(denaturing high- performance liquid chromatography,DHPLC) 是利用DNA構型改變檢測基因突變和遺傳多態性的方法之一，其可以檢測單核苷酸多態和可遺傳的突變。實驗主要過程包括PCR 擴增待測和正常DNA樣品，將擴增產物變性後再復性，若存在突變，在這一復性過程中可形成異源雙鏈。在部分變性條件下，高壓液相色譜分析可以有效地區分由變異鹼基與正常鹼基形成的異源DNA雙鏈和正常DNA雙鏈。由於DHPLC 的解析度可達到1bp/ kb，而且操作過程可以全部程式化、大規模化和自動化，使得實驗時間大大縮短，實驗準確率提高，可作為大群體任何基因突變初篩的有力手段，比SSCP 有更多的優越性，具有廣泛的套用前景，許多工作都已經證實了DHPLC的敏感性、有效性和準確性。

特異性等位基因擴增

等位基因特異性擴增法（allele- specific amplificarion,ASA) 是基於PCR技術的一種單核苷酸突變檢測法，是分析已知鹼基替代或微小片段缺失和插入型突變的常規技術。在PCR 的引物設計中，根據已知突變位點性質在引物3 ' 端或中間設計一錯配鹼基，使之僅能與突變型或野生型基因互補而只擴增突變型或野生型基因。

ASA技術只需一步PCR反應，甚至無需電泳和標記技術。因其快速，重複性強，耗資少，無同位素污染以及高效性等特點，將成為有前途的適應於人群大規模突變篩查的方法。套用該方法最好避免錯配鹼基為G: T，這種錯配可能引發擴增反應。

化學裂解錯配鹼基法

化學裂解錯配鹼基法（chemical cleavage mismatch,CCM) 通過化學修飾並切割異源DNA雙鏈中錯配鹼基，達到檢測點突變的目的。其原理是末端標記的DNA片段暴露於可以識別並修飾異源雙鏈中錯配鹼基的化學試劑中（如錯配的胞嘧啶可被羥胺修飾，錯配的胸腺嘧啶可被四氧化鋨修飾），被修飾的位點隨即可被雜氮環已烷等化學物質裂解。DNA修飾裂解後，電泳觀察DNA片段長度即可知道突變是否存在。該技術較其他突變檢測系統有更多的優越性，可以掃描1~ 2 kb 的大片段DNA並在隨後的順序分析中定位突變位點，其效率可達100%。該手段通常首先對目標DNA和野生型DNA進行PCR 擴增，然後對野生型DNA擴增片段進行末端標記，標記片段作為探針與目標序列復性形成異源雙鏈，用四氧化鋨（OsO4） 或羥胺（hydroxylamine) 修飾並用哌啶（piperidine) 切割，聚丙烯醯胺電泳分離不同長度的片段。近年來，有人採用碳化二亞胺作為錯配修飾劑，進一步提高了該方法的敏感性。CCM方法最初採用同位素DNA片段，用螢光標記代替同位素後，稱之為螢光化學裂解錯配鹼基法（FCCM），該方法依然比較敏感並且安全，可檢出95%~ 100%的錯配。化學裂解錯配鹼基法的不足之處在於工作量大，需要使用有害化學物質作為試驗用試劑。

套用

分子生物學技術：可套用於遺傳性疾病的研究和病原體的檢測及腫瘤的病因學、發病學、診斷和治療等方面的研究提高到了基因分子水平。

生物學定義：生物學是研究生命現象和生物活動規律的科學。

據研究對象分為動物學、植物學、微生物學、古生物學等；依研究內容，分為分類學、解剖學、生理學、細胞學、分子生物學、遺傳學、進化生物學、生態學等；從方法論分為實驗生物學與系統生物學等體系。