基本介紹
概述
從破裂或損傷的血管中，血液自行流出至血小板栓子形成暫時止血，稱為止血過程。許多病理因素可影響這一過
程而導致出血不止，為此，設計了許多試驗尋找這一病理生理的原因，比如：內皮素測定，血管性血友病因子(vWF)測定，血小板聚集試驗，等等。這些試驗靈敏，但操作複雜，常先用出血時間檢驗作為篩選試驗，如為陽性結果，再做上述試驗。
測定方法
出凝血時間出血時間測定有三種方法：即，Duke法、Ivy法、出血時間測定器法。Duke法：操作雖簡單，但穿刺深度，寬度難以標準化，且受穿刺部位毛細血管分布及血管收縮程度的影響，致使實驗的敏感性很差。文獻記載，血小板低於3×109/L的患者陽性率僅為4 2%，遺傳性假血友病(VWD)患者陽性率為32%，而測定器法分別為92%和67%。Ivy法：雖較Duke法敏感，操作繁瑣，又是損傷性的，切口難以標準化，也不易住推廣。出血時間沉定器法：由於刀片埋裝在儀器內部，由彈簧快速彈出,使切口深度，寬度易於控制，可標準化且靈敏度高。因此，檔案中規定出血時間測定實驗應使用出血時間測定器法，而廢除Duke法。
臨床意義
出凝血時間1.當血小板數目減少或功能缺陷時，不能形成血栓，出血時間即延長。常見於血小板減少性紫癜、急性白血病、再生障礙性貧血等。嚴重的凝血酶原減少亦可引起出血時間延長。2.出現時間除了與血小板的數量與機能有關外，還與毛細血管的收縮和粘合能力以及血清素等物質的釋放有關。如毛細血管病變，收縮功能障礙出血時間也延長。3.由於毛細血管原因所引起的出血時間延長，如血管性假血友病，常常是在身體某一部位出血時間延長，而其他部位正常，因此，必須同時做兩側耳垂或手指的出血時間測定，以資鑑定。
凝血測定
概述
出凝血時間凝血時間試驗是指血液自血管抽出放入試管中，從液態的溶膠狀態轉為半固體凝膠狀態所需要的時間。出血後，血液(或血漿)中的 Ⅻ因子被激活後，處於酶原狀態的凝血因子Ⅻ,Ⅺ,Ⅸ,Ⅷ,Ⅹ,Ⅴ依次被激活，連續"放大"，最終使纖維蛋白原生成纖維蛋白。後者呈網狀結構，網羅血小板栓子和紅細胞後，收縮形成牢固的血塊。這一過程需要Ⅻ、Ⅺ、Ⅸ、Ⅷ、Ⅹ、Ⅴ、Ca2+、凝血酶原及纖維蛋白原等凝血因子的參與，其中任一因子缺乏均可引起上述"連續放大"過程障礙，造成凝血不良。因此凝血時間延長，可反映上述因 子缺乏。此試驗反映記錄的是整個凝血過程，對Ⅺ,Ⅸ,Ⅷ因子較為敏感，只有凝血酶原,凝血因子X,纖維蛋白原明顯減低時才顯示實驗結果延長。
測定方法
出凝血時間凝血時間實驗大致有6種測定方法。王鴻利等用6種凝血時間測定對12例重型血友病（Ⅷ因子活性<1%），4例中型血友病（ Ⅷ因子活性1%~5%）進行測定，結果（檢出率/病例數）為：毛細血管法，重型1/12，中型0/4；玻片法，重型2/12，中型0/ 4；普通試管法，重型12/12，中型2/4；APTT，重型12/12，中型4/4；矽化管，重型12/12，中型4/4；ACT法，重型12/12，中型4/4。從中可以看出，毛細血管法和玻片法很不敏感，不能再用於Ⅺ、Ⅸ、Ⅷ因子的篩選實驗。普通試管法簡單且較敏感，標本用量較少，可用於常規檢查，但由於手工操作，需注意實驗器材的標準化。APTT簡便快速，市面上有各型凝血儀，可用於不同規模實驗室，且有配套的試劑、質控物、校準物，易於質量控制，是較理想的常規實驗方法。APTT也可手工完成，但影響因素較多，在標本量較多時，不適用。
臨床意義
1 .凝血時間延長，主要見於血液中凝血因子缺乏或抗凝物質增加時，如血友病、肝脾病、急性傳染病等。血友病患者的凝血時間可長達1~2小時以上。血液中抗凝物質增多常見於套用肝素治療時，如斷肢再植術後。此外，血小板嚴重減少時亦可引起凝血時間延長。2.凝血時間縮短主要見於各種原因如休克，急性腎功能衰竭、敗血症等引起的彌散性血管內凝血（簡稱DIC)。反覆測定凝血時間，如每次都短於3分鐘，說明血液有凝固的趨勢，即應當想到有血管內凝血(DIC)D的可能。
診斷指標
出凝血時間為了避免術中出血,手術前進行出血傾向的檢查非常必要,由於影響止血的因素很多,但又不可能做許多實驗,因此,以往常規中用出血時間和凝血時間作為診斷指標,結果異常時再進一步做較複雜的試驗尋找病因.前已述及,Duke法雖簡單適於常規套用,但敏感 性很差,不能達到診斷要求,而出血時間測定器方法,操作複雜,費時,不適合常規使用.雖是反映血管,血小板數量和質量方面的病理 變化,但臨床最常見的是血小板減少引起變化.而血管性疾病和血小板質量異常引起的疾病多是遺傳性疾病,發病率很低,且基本上能在 臨床表現,體徵和病史中反映出來,可提示做一些確診
試驗.從這個意義上講,手術前只要做一項血小板計數而不做出血時間,也基本上 能保證手術前篩查的要求。
檢測方法
血標本的採取應注意的問題
1. PT,APTT凝血實驗檢查均使用靜脈血.採血人員應技術熟練,以防止組織損傷,外源性凝血因子進入針管.2.凝血實驗標本最好不與其他實驗一起採集,否則由於標本的分配,分裝等使用血液停留在針管的時間延長.一般血液採集,進入 容器至進行實驗所用的時間越短,所分析的凝血因子被保護得越好.從輸液三通管取出血的做法不可取. 3.取血時病人應鬆弛,環境溫暖,防止靜脈攣縮,止血帶的壓力要儘可能小,壓力大及束縛時間長可影響局部血液的濃縮和內皮細 胞釋放組織纖溶酶原活物(t-PA),後者將引起纖溶性增強,血小板短和內徑應標準化,國際上推薦用21G1.5或20G1.5 針頭.取血時,拉針栓的速度要慢而均勻,使血液平穩地進入注射器,防止氣泡的產生. 4.一旦取樣完畢,立即與抗凝劑充分混合,一般提倡使用真空採血管.此管有充分的透明度,根據取血量設計,有2.0,5.0 ,10ml各種血液收集管,真空負壓並有定量的抗凝劑,能保證抗凝劑與取血量的比例,且能有充分的空間便於血液和抗凝劑混合. 5.用矽化玻璃或塑膠注射器採血.考慮結果的精確性,應將試管刻度的可能誤差控制在既定體積的10%以內.6. 採血後標本在低溫保存且在一定時間範圍內.筆者曾對不同條件保存的血漿因子變化進行了探討,結果顯示在32℃保存血漿6,12, 24hⅧ因子活性可分別消失50%,60%95%,即使保存在4℃也分別消失5%,55%,70%.V因子活性在32℃分別消失 25,40,80%,而在4℃則僅損失0%,5%,10%.因此測定APTT的血漿在-80℃至少可保存1個月,4℃為6h,2 0℃為6h,而32℃僅為血漿,在4℃為24h,20℃為6h,32℃為2h. 7. 國際血液學標準化委員會(ICSH),國際血栓與止血委員會(ICTH)推薦使用3.2g/dl(含2H2O)或0.109mo l/L的枸櫞鈉作為凝血因子檢查的抗凝劑.另外,近年來,許多試驗室採用緩衝抗凝劑,這種試劑對標本經冷凍保存後再行分析更為適 宜.因為無緩衝劑,血漿pH值隨時間而增加,凝固時間可延長,特別是Ⅷ因子即使是在-20℃保存,其凝血活性也可減少50%.緩 沖劑的作用是維持血漿恆定pH,防止易變因子失活.抗凝劑在血標本的絕對含量可改變血漿中鈣離子濃度,進而影響試驗結果,一定要 注意採血時血液與抗凝劑的比例.應指出,所謂血液與抗凝劑按9:1比例混合,實際上是指抗凝劑與正常壓積血液之間的比例而言.因 此應根據患者紅細胞比例(Hct)狀況隨時調整抗凝劑用量.
套用試劑應注意的問題
1. 凝血活酶應注意的問題:(1)組織凝血活酶標準化套用的國際參考品(international reference preparation, IRP),有下列幾種:單一組織凝血活酶國際參考品:是一種組織提取物的生理鹽水懸液製劑.WHO在英國使用的統一標準的"英國 比較凝血活酶",編號67/40.同時又以BCT67/40為基礎標準化了次級參考品.如牛腦組織凝血活酶,編號68/434; 兔腦為70/178等.複合組織凝血活酶國際參考品:它是組織提取物的生理鹽水懸液中加入適量纖維蛋白原,因子V和氯化鈣組成的 製劑,如牛組織凝血活酶OBT/79等.(2)組織凝血活酶工作製劑的國際敏感指數(ISI),由於不同組織凝血活酶對凝血因子 的敏感性不同.為了使不同敏感性的組織凝血活酶在檢測PT中能得到同樣的結果,必須要制定一個共同的敏感性指標.自製的試劑要與 國際參考品(IRP)進行比較,然後得出一個校正值(即ISI).ISI值越接近於1.0,表明組織凝血活酶試劑越敏感,因此, 生產和出售得產品必須標有ISI.(3)儀器特有的ISI:上述PT根據報告方式適用於手工法(試管傾斜法)測定PT.但是手工 法與儀器法以及儀器法與儀器法測定PT的國際標準化比值(INR)之間,仍有差異.為此,專家們提出建議:同一組織凝血活酶試劑 用於不同儀器時,可用所謂的"儀器特有的ISI"或稱區域性ISI來計算INR.每台儀器所用的凝血活酶試劑都應該有特定的IS I值,重新標定ISI值的做法是購買標有INR的凍乾血漿,然後在自己的儀器上再標定所使用凝血活酶試劑的ISI值,這樣才可使 病人的INR具有可比性.(4)某些凝血活酶和部分活化凝血活酶並不一定與某此儀器相匹配.渾濁的或含微粒的凝血活酶和部分活化 凝血活酶不能運用通過光學系統測定終點的儀器進行檢測.(5)凝血活酶和部分活化凝血活酶的使用步驟必須嚴格按照說明書進行.通 常在使用前必須充分混勻試劑,以使微粒重新均勻懸浮於液體中.按說明書要求的溫度存放試劑,並且試驗過程中,將試劑置於37℃下 的時間不能長於說明書中規定的溫度.(6)做APTT實驗時所用的活化劑不同,對血內肝素,狼瘡抗凝物質及因子Ⅷ,Ⅸ缺乏症的敏 感性也不同,要根據檢測項目來選擇不同活化劑的APTT試劑.同樣PT延長時反遇有關凝血因子中單一因子或幾個因子缺陷引起的病 理現象,由於不同疾病可能僅反映某一因子的變化,因此一種特定試劑不可能對這些疾病的變化的敏感性一致.由於不同廠家生產的PT 試劑質量不同,因此,同一份標本用不同PT試劑其結果可有明顯的差異.因此PT實驗最好採用INR的報告方式. 2. 試劑準備過程中應該使用去離子水.如果pH值增高的水沒有得到適當的緩衝,將會延長測定結果.如果用含氨的水配製抗凝劑,會導致 V因子活性快速降低,從而延長凝血酶原時間.凝血活酶,部分活化凝血活酶,緩衝液和抗凝劑須在4-10℃條件下貯存,但在室溫下 保存氯化鈣和水.3. 正常對照血漿通常將多份健康人血標本混在一起,以彌補個體誤差.正常對照血漿要求20份以上健康,年齡在18-55歲間的男女個 體,且刪除服藥者,須在平靜,休息狀態抽血.樣本離心取出血漿後混勻,分裝小瓶,凍存於-80℃備用,或冷凍乾燥. 4. 參比血漿:標準化是質控的重要組成部分,方法標準化對有的實驗室來說是困難的,因有設備條件方面的限制.為了使結果大同一實驗室 的不同時期具有可比性,必須使用標準品或參比血漿.WHO已建立了10多種國際標準品.
設備與儀器應注意的問題
1. 玻璃器皿的要求:貯存和測試時應選用乾淨,沒有劃痕的試管.酸清洗法(鹽酸3mol/L)被公認為適用於凝血研究清洗玻璃製品的 最佳方法.玻璃製品必須通過徹底沖洗,以去除殘留的酸,避免改變容器表面的pH值.一次性玻璃和塑膠製品分開保存.手工法PT或 試管法全血凝固時間測定時,試管口徑為8mm,直徑越大,CT越長. 2. 溫度的要求:人工測定終點法要求水浴箱的溫度必須保持在(37±1)℃,並且周圍照明設備要好,便於讀取終點.如果為了讀數而將 試管從水浴箱中拿出,傾斜觀察,此時動作應迅速,否則試管中的血漿溫度將很快下降. 3. 儀器的選擇:自動終點測定法有半自動和全自動兩種類型,區別在於前者在試劑和血漿移液步驟上仍是手工的;而後者完全由儀器自動操 作.自動終點法測定所得結果重複性好,大大提高了不同試驗室結果間的可比性. 應該根據儀器的精密度,可靠性,使用和維修的簡易程度來選擇所購買儀器.現在已有不少用合成底物法代替以凝固為終點的生物學測定 法的報導.但是,這兩種測定方法的臨床意義不盡相同.
實驗操作應注意的問題
1. 許多試驗誤差都來源於技術的錯誤.在實驗技術,試劑,溫度及pH值上很微小的變化都會導致試驗結果明顯的變化.孵育時間與溫度是 在一期法凝血酶原時間測定時應嚴格控制的參數.血漿不能在37℃下放置超過10min,凝血活酶放置時間也不能超過說明規定的時 限.2. 手工法PT或試管法CT檢查時,傾斜試管動作一定要輕,角度要小,以減少血液與管壁的接觸面積.同一標本要做二管(有文獻報告試 管法CT檢查要3管)並取均值報告.每批實驗必須有正常對照.3. 血液凝固主要是酶催化的反應,所以實驗過程中要嚴格控制理想的pH環境和溶液的離子強度.多數常規試驗都在處於血液生理pH值緩 沖範圍的緩衝系統中進行.反應混合物的pH值必須處於7.2-7.4之間. 4. 試驗結果準確還取決於所用的反應物的量,加入順序和不同反應物的孵育時間.如每次APTT試驗時,活化部分凝血活酶試劑和血漿混 合物的孵育時間必須一致. 混勻過程決定了APTT試驗中接觸活化的量,在孵育時如果在活化部分凝血活酶與血漿混合的技術不佳,將會改變測定結果。5. APTT,PT需乏血小板血漿.一般3000r/min離心10min後分離血漿.離心前注意標本量,離心後注意血漿的量(Hc t)以保證抗凝劑與標本量最適比例.6. 試驗前檢查血漿是否有溶血,黃疸,脂血和出現凝塊.紅細胞膜含有磷脂,溶血標本具有與血小板第Ⅲ因子(磷脂)相似的凝血活性,這 種磷脂能縮短溶血血漿的APTT值.標本中如果出現凝塊,無論凝塊多么小,均會影響試驗結果. 7. 報告方式:(1)以PT的秒(s)數報告.(2)以患者PT(s)/正常對照(s)的比(PTR)報告.(3)在口服藥物治療監 控時以INR報告.(4)ICSH規定,不再用百分比(活動度)報告.(5)APTT以秒報告。
繪製質控圖監測儀器,試劑
繪製質控圖並隨時分析其變化趨勢是質量控制的重要手段.在每天工作中,同時測正常和氨基常對照血漿(商品或自製),並用Le vey-Jeuny質控圖檢查有無失控.其步驟為,首先在常規的實驗條件下(包括高素質的實驗人員,規範的操作,穩定的儀器), 對質控品至少進行10次測量,計算出X及標準差,然後繪出質控圖,質控物的X值為基線,縱軸有X±2s.每次試驗時質控物與標本 一起檢測,並把當日的結果點在圖表上.下列的質量變化圖形有利於操作人員判斷結果是否有所失控.當失控時,按下述步驟(圖1)檢 查原因.室間質評:各實驗室必須積極參加由檢驗中心組織的室間質評活動,以便了解本單位的結果準確性,因儀器和試劑不同,同一份質控 血漿可行到不同結果,應將回報結果根據儀器試劑分組比較.
參考值
文獻報導，手工法APTT的參考值為31.5-43.5s,女性為32-43s.兩者無顯著差異。
受檢查的測定值較正常對照延長超過10s以上才有病理意義.手工法PT參考值為11-14s,超過正常對照3s為異常,PT R參考值為1±0.15.
因儀器、試劑的不同,會得到不同的結果，因此儀器法很難規定統一的參考值，各實驗室應根據自己的儀器、試劑等條件,自行測定一批健康人,建立參考值.此後至少每年或條件有變化時,根據新的條件,重新建立參考值.至少選擇40名18-55歲之間男性及非妊娠,月經期女性(男女各半)、身體健康,半月內無服藥史,在平靜休息的狀態採血且分開幾天採血和測定(以減少批間差異).在常規檢測示本的條件下進行試驗.測定結果經統計學處理,計算標準差,取95%可信限為參考值範圍。
