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亨利二世駕崩之後,弗朗索瓦·德·昂古萊姆王子繼承王位,然而幼年的王子體弱多病,凱薩琳以王太後的身份宣布攝政。她無視法國大貴族吉斯公爵和紅衣主教兩兄弟的諸多阻撓,把他們的勢力趕出法蘭西,從而實現了獨掌朝政的願望。弗朗索瓦二世和查理九世(兩人都是凱薩琳和亨利的孩子),凱薩琳又把她的兒子亨利·德·昂古萊姆擁上王位,不過這次,“無冕女王”凱薩琳面臨著新教徒們的挑戰。她本人狂熱的信仰天主教,但同時也希望於新教達成默契,這就是為什麼她極力把女兒伊莉莎白嫁給信仰信教的西班牙國王,有極力撮合兒子阿朗松公爵和英格蘭女王伊莉莎白一世的婚姻。王太後為鎮壓新教奇異而大肆殺戮,結果得到了“血腥皇後”的稱號。
1589年,凱薩琳·德·美第奇逝於法國,時年70歲。