內切肽鏈酶

內切肽鏈酶

內切肽鏈酶

糖蛋白是蛋白質中的胺基酸側鏈被糖基化修飾後的蛋白質，廣泛存在於生物體中，具有特殊的生物學功能。研究糖蛋白的傳統方法一般是將糖鏈切掉並分離純化後再分別進行研究。採用基質輔助雷射解吸/電離飛行時間質譜（MALDI-TOF-MS）——這一軟電離生物質譜技術，可直接測定糖蛋白的平均分子量及糖含量，套用蛋白酶切及內切糖苷酶酶切相結合的方法，可確定糖基化位點及糖苷鍵類型。
一、糖蛋白平均分子量及糖含量的測定：
在糖蛋白MALDI-TOF-MS質譜圖上表現為一簇峰，各峰之間約相差一個或幾個糖基，同時還出現多電荷峰，有些樣品中還含少量不帶糖鏈的蛋白峰。糖蛋白的分子量為這些多重峰的平均值。
從不含糖鏈的蛋白的分子量可以直接得到糖含量，但因其豐度太小難以準確測定。採用內切糖苷酶F將糖鏈切除，得到含一個GlcNAc的肽鏈，肽鏈與糖蛋白平均分子量之間的差值即為糖鏈的分子量，糖鏈的分子量與糖蛋白平均分子量的比值即為糖含量。

二、糖苷鍵類型及糖基化位點的測定：糖基化位點的確定，則必須依賴一系列酶切反應的實現來加以證實。一般步驟是：①先將糖蛋白還原烷基化、脫鹽，加Glu-c酶切，產物再用內切糖苷酶酶切，含糖肽段峰將出現位移。採用差位酶切法對其進行驗證：內切糖苷酶F（Endoglycosidase-F）切斷N-糖鏈中五糖核心區中,兩個N-已醯氨基葡萄糖間的內糖苷鍵，而糖N肽酶F（PNGase-F）切斷糖鏈與天冬醯氨間的糖肽鍵，兩者相差一個N-已醯氨基葡萄糖（194Da）；②凝集素對糖肽的提取：凝集素是一類糖結合蛋白，能專一地識別某一特定結構的單糖或寡糖中特定的糖基序列並與之結合。核糖核酸酶B中的糖鏈為高甘露糖型，我們選用其特異性吸附凝集素----伴刀豆球蛋白（ConA）對含糖肽段進行提取，並直接進行MALDI-TOF-MS檢測，為今後糖肽序列分析及糖鏈結構分析奠定了基礎。