簡介
當前引物合成基本採用固相亞磷醯胺三酯法。
亞磷醯胺三酯法合成dna片段，具有高效、快速的偶聯以及起始反應物比較穩定的特點。亞磷醯胺三酯法是將DNA固定在固相載體上完成DNA鏈的合成的，合成的方向是由待合成引物的3'端向5'端合成的，相鄰的核苷酸通過3'→5'磷酸二酯鍵連線。
合成步驟
第一步是將預先連線在固相載體CPG上的活性基團被保護的核苷酸與三氯乙酸反應，脫去其5'-羥基的保護基團DMT，獲得游離的5'-羥基。
第二步，合成DNA的原料，亞磷醯胺保護核苷酸單體，與活化劑四氮唑混合，得到核苷亞磷酸活化中間體，它的3'端被活化，5'-羥基仍然被DMT保護，與溶液中游離的5'-羥基發生縮合反應。
固相亞磷醯胺法合成引物第三步，帶帽(capping)反應，縮合反應中可能有極少數5'-羥基沒有參加反應(少於2%)，用乙酸酐和1-甲基咪唑終止其後繼續發生反應，這種短片段可以在純化時分離掉。
第四步，在氧化劑碘的作用下，亞磷醯形式轉變為更穩定的磷酸三酯。
經過以上四個步驟，一個脫氧核苷酸被連線到固相載體的核苷酸上。再以三氯乙酸脫去它的5'-羥基上的保護基團DMT，重複以上步驟，直到所有要求合成的鹼基被接上去。合成過程中可以觀察TCA處理階段的顏色判定合成效率。
通過氨水高溫處理，連線在CPG上的引物被切下來，通過OPC,page等手段純化引物，成品引物用C18濃縮,脫鹽，沉澱。沉澱後的引物用水懸浮，測定OD260定量，根據定單要求分裝。
