lamp[環介導等溫擴增反應]

lamp[環介導等溫擴增反應]

lamp[環介導等溫擴增反應]

2000年日本學者Notomi在Nucleic Acids Res雜誌上公開了一種新的適用於基因診斷的恆溫核酸擴增技術，即環介導等溫擴增技術英文名稱為“Loop-mediated isothermal amplification”,受到了世衛組織WHO、各國學者和相關政府部門的關注，短短几年，該技術已成功地套用於SARS、禽流感、HIV等疾病的檢測中，在2009年甲型H1N1流感事件中，日本榮研化學株式會社（以下簡稱“榮研公司”）接受WHO的邀請完成了H1N1環介導等溫擴增法檢測試劑盒的研製，通過早期快速診斷對防止該病症的快速蔓延起到積極作用。通過榮研公司近十年的推廣，環介導等溫擴增技術已廣泛套用於日本國內各種病毒、細菌、寄生蟲等引起的疾病檢測、食品化妝品安全檢查及進出口快速診斷中，並得到了歐美國家的認同。該技術的優勢除了高特異性、高靈敏度外，操作十分簡單，對儀器設備要求低，一台水浴鍋或恆溫箱就能實現反應，結果的檢測也很簡單，不需要像PCR那樣進行凝膠電泳，環介導等溫擴增反應的結果通過肉眼觀察白色渾濁或綠色螢光的生成來判斷，簡便快捷，適合基層快速診斷。

環介導等溫擴增方法優點：靈敏度高（比傳統的PCR方法高2～5個數量級）；反應時間短（30～60分鐘就能完成反應）；臨床使用不需要特殊的儀器（試劑盒研發階段推薦用實時濁度儀）；操作簡單（不論是DNA還是RNA，檢測步驟都是需將反應液、酶和模板混合於反應管中，置於水浴鍋或恆溫箱中63℃左右保溫30～60分鐘，肉眼觀察結果）。

環介導等溫擴增方法缺點：靈敏度高，一旦開蓋容易形成氣溶膠污染，加上目前國內大多數實驗室不能嚴格分區，假陽性問題比較嚴重，因此我們強烈推薦在進行試劑盒的研發過程中採用實時濁度儀，不要把反應後的反應管打開；引物設計要求比較高，有些疾病的基因可能不適合使用環介導等溫擴增方法。

目前國內基因診斷常採用PCR方法，涉及到PCR儀，該儀器價格國產和進口價格不一，便宜的2～3萬也能買到，貴的20多萬。條件比較好的實驗室和國家機構也有嘗試螢光定量PCR方法的，該方法技術含量高，必須使用螢光定量PCR儀，價格在20～70萬不等。

使用環介導等溫擴增技術的產品在臨床診斷中是不需要特殊儀器的，但臨床使用的成品試劑盒在研發過程中由於涉及引物的選擇，引物濃度的調整，及反應溫度和時間的最佳化，需要用一種量化的方式去幫助研究者分析選擇數據，因此我們推薦使用榮研公司的專利產品LA-320C或LA-500實時濁度儀。

環介導等溫擴增法，英文名稱為loop-mediatedisothermal amplification，，是一種新型的核酸擴增方法，其特點是針對靶基因的6個區域設計4種特異引物，在鏈置換DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)的作用下，60--65℃恆溫擴增，15-60分鐘左右即可實現10^9～10^10倍的核酸擴增，具有操作簡單、特異性強、產物易檢測等特點。在DNA合成時，從脫氧核糖核酸三磷酸底物(dNTPs)中析出的焦磷酸離子與反應溶液中的鎂離子反應，產生大量焦磷酸鎂沉澱，呈現白色。因此，可以把渾濁度作為反應的指標，只用肉眼觀察白色渾濁沉澱，就能鑑定擴增與否，而不需要繁瑣的電泳和紫外觀察。由於環介導等溫擴增反應不需要PCR儀和昂貴的試劑，有著廣泛的套用前景。