概述
目的:總結並改進細胞體外侵襲實驗的操作經驗。結果:改進後侵襲試驗定位準確，結果清晰。結論：按照作者建議的方法操作，能夠縮短實驗時間,有助於提高細胞體外侵襲實驗的質量。
細胞體外侵襲實驗主要套用於各種細胞因子對惡性腫瘤細胞侵襲和轉移的影響及一些抑制血管生成的新藥研究,但在具體實驗中獲得真實、最佳實驗結果的圖像,並藉以說明問題並非簡單。
很多研究人員在此方面花費了很多時間和科研經費,從刺激實驗用的細胞到蘇木素染色,看似簡單的實驗步驟中有很多環節需要研究者注意.
材料與方法
1. 1
Matrigel：Becton Dickinson Compary, - 20 ℃保存；
Transwell plate：Costar ,USA , # 3422 ,聚碳酯膜微孔直徑為8μm；
蘇木素染液，梯度乙醇，二甲苯溶液。
1. 2 趨化因子的製備 取傳代第二天長勢良好的NIH3T3細胞,無血清培養基輕柔漂洗兩次; 加入無血清培養基,37℃,5 %CO2 培養24 h～48h，收集細胞培養上清；4 ℃,12 000rpm 離心,10 min ,取上清；0.22 μm 濾膜過濾除菌；分裝,在- 20 ℃保存。
1. 3
transwell 培養板準備 所有操作均需無菌操作。-20℃保存的Matrigel 在冰上保2℃～8℃過夜融化。在冰上用預冷的槍頭吸取100μl Matrigel 加入冰預冷的300μl 無血清培養基中,充分混均。取上述稀釋的Matrigel 25 μl 加入transwell 板上室,覆蓋整個聚碳酯膜,37 ℃,30 min ,使Matrigel 聚合成膠。已鋪好Matrigel的transwell 培養板置於37℃可保存2 周。
1. 4
Matrigel 侵襲實驗(Matrigel Invasion Assay)刺激後的各組細胞用PBS 漂洗3 次。以常規方法用無血清培養基製備單細胞懸液,5 ×105個細胞/ ml ,每組細胞各分為兩部分。胎盤蘭拒染實驗,細胞活力需大於95 %。Transwell 培養板上室加入100μl 細胞懸液( 5 ×104 個) 並加入無血清培養基200 ul 。Transwell 培養板下室加入500μl 趨化因子,37℃,5 %CO2 培養24 h。
用濕棉簽輕輕擦去Matrigel 凝膠和聚碳酯膜上表面的細胞。小心取出上室,用線拴住,並做好標記,用冰預冷的甲醇固定30 min。蘇木素染色1 min。
梯度乙醇脫水(80 % ,95 % ,100 %) ,二甲苯透明。小心將聚碳酯膜自上室基底切取下來,置載玻片上中性樹脂封片。附著於聚碳酯膜下表面的細胞在高倍鏡下( ×400) 隨機取6 個視野[1 ] 計數,取平均數。重複實驗兩次。
注意事項
2. 1
NIH3T3 細胞製備的趨化因子與胎牛血清 趨化因子是能使細胞產生趨化運動的一類細胞因子[2 ] 。目前利用NIH3T3 細胞製備趨化因子做細胞體外侵襲實驗的實驗室比較多,時間較長且實驗步驟繁瑣。眾所周知,胎牛血清中有趨化因子,我們在不同濃度TNFα刺激下的HCCC29810 膽囊癌細胞體外侵襲能力的強弱實驗中發現用胎牛血清和用NIH3T3 細胞製備的趨化因子做細胞體外侵襲實驗效果是一樣的,兩組遷移的細胞數很接近。
在實驗時間上，用NIH3 T3細胞製備趨化因子做細胞體外侵襲實驗周期為1 周,而用胎牛血清作趨化因子做細胞體外侵襲實驗周期為2 d ,實驗時間節省了很多。因此認為可以用胎牛血清來代替NIH3T3 細胞製備的趨化因子。
2. 2 細胞的準備 所需細胞應處在對數生長期,細胞活力需大於95 %。如果細胞活力小,就會造成細胞穿透能力下降,影響實驗結果。
2. 3 擦去Matrigel 凝膠和聚碳酯膜上表面的細胞 先用乾棉簽將上室內液體吸去,再用蒸餾水浸濕的棉簽輕輕擦去Mat rigel 凝膠和聚碳酯膜上表面的細胞,如果沒有擦淨聚碳酯膜上表面的細胞,在細胞計數時就會將沒擦掉的細胞也計進來。尤其是細胞為圓形的時候,就會分辨不出是穿過去的細胞還是沒穿過去的細胞,對於長梭形細胞來說,穿過去的細胞為長梭形,沒穿過去的細胞多為圓形。
2. 4 蘇木素染色 上室浸泡在新蘇木素中的時間為1 min ,用過多次的蘇木素為2 min。在研究粉防己鹼對HUVEC 人類臍靜脈內皮細胞遷移能力的抑制作用沒有將多餘蘇木素洗去,直接脫水、透明,造成細胞圖片背景模糊,細胞不清楚。
在作不同濃度TNFα刺激下的HCCC29810 膽囊癌細胞體外侵襲能力的強弱實驗時我們將其置於盛有自來水的燒杯中,反覆漂洗幾次,將多餘蘇木素洗去再行脫水、透明;這樣做出的細胞圖片背景乾淨,細胞清楚。
2. 5 脫水和透明時間 脫水時間各為1 min ,在二甲苯中的時間不要過長,以2 min～3 min 為宜;尤其是同時操作多個樣本時,時間過長就會造成部分聚碳酯膜從上室基底部自動脫落下來,上室間粘連在一起,造成樣本混淆,實驗失敗。建議在最後一步實驗時需二人協做,一人辨別並取出樣本,一人小心將聚碳酯膜自上室基底切取下來,置載玻片上中性樹脂封片並及時編號。
2. 6 細胞計數 當實驗用的細胞為圓形時,實驗人員容易將聚碳酯膜上小孔誤認為細胞進行計數。我們在作VEGF 對人結腸癌HT229 細胞體外侵襲能力的影響時,發現HT229細胞很小,很容易將聚碳酯膜上小孔誤認為細胞進行計數 。
