T4核苷酸激酶廣泛用於DNA和RNA的5'末端標記,標記時以[y-"P]ATP作為底物。採用轉移反應可獲得高水平的末端標記,但反應前必須除去5'端未標記的磷酸基。5'端標記的DNA和RNA可用於:核酸的定序分析、部分酶切法繪製限制酶圖譜、DNA或RNA的指紋分析、經DNase或甲基化保護的DNA足跡分析(DNA-footprinting)及分子雜交研究等。用於DNA或RNA連線酶作用底物的DNA或RNA分子也必須首先進行5'端磷酸化才可用於連線反應,限制酶人工接頭(linker)與DNA分子連線前也必須用此激酶磷酸化。
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