套用範圍和優點
適用於 對於沒有獲得全基因組序列的物種的轉錄組進行研究。優點是可以得到大量的EST長序列。
技術流程
文庫構建→→油包水PCR→→454測序
流程說明
文庫構建
1) 液氮保存新鮮的組織樣品，提取高質量的總RNA;
2) 使用Oligo d(T)柱子純化mRNA；
3) 改進的3’Primer逆轉錄合成cDNA（SMART方法）;
改進的3’Primer（加入BsgI酶切位點）為：
5'- ATT CTA GAG GCC GAG GC gtgcag d(T)18 VN -3'
(N=A,G,C,or T;V=A,G,or C)
4) BsgI酶切去除PolyA；
5) 雙鏈cDNA片段化；
6) 連線454特有的A & B接頭;
7) 使用磁珠篩選去除接頭自連片段;
8) 片段篩選，保留一端是A接頭、一端是B接頭的片段;
9) 氫氧化鈉變性，產生單鏈DNA文庫。
油包水PCR (Emulsion PCR)
1) DNA片段和捕獲磁珠混合;
2) 礦物油和水相的劇烈震蕩產生油包水環境;
3) DNA片段在油包水環境中擴增;
4) 破油並富集有效擴增磁珠。
454 測序
1) PTP準備和清洗;
2) 富集磁珠塗布於PTP;
3) 塗布其他反應成分和包埋磁珠;
4) PTP置於儀器開始測序。
