![分子克隆實驗指南[分子克隆實驗指南（第四版）]](/img/5/f71/nBnauM3X1AzM5QDOxkTN0ETN1UTM1QDN5MjM5ADMwAjMwUzL5UzL3IzLt92YucmbvRWdo5Cd0FmL0E2LvoDc0RHa.jpg "分子克隆實驗指南[分子克隆實驗指南（第四版）]")
內容簡介
分子克隆技術30多年來一直是全球生命科學領域實驗室專業技術的基礎。冷泉港實驗室出版社出版的《分子克隆實驗指南》一書擁有的可靠性和權威性，適用於對所有分子生物學技術實驗有需要的研究人員。
第四版的《分子克隆實驗指南》保留了之前版本中備受讚譽的細節和準確性，10個原有的核心章節經過更新，反映了標準技術的發展和創新，並介紹了一些前沿的操作步驟。同時還修訂了第三版中的核心章節，以突出現有的核酸製備和克隆、基因轉移及表達分析的策略和方法，並增加了12個新章節，專門介紹最激動人心的研究策略，包括利用DNA甲基化技術和染色質免疫沉澱的表觀遺傳學分析、RNAi、新一代測序技術，以及如何處理數據生成和分析的生物信息學，例如介紹了分析工具的使用，如何比較基因和蛋白質的序列，鑑定多個基因的常見表達模式等。本書還保留了必不可少的附錄，包括試劑和緩衝液、常用技術、檢測系統、一般安全原則和危險材料。
目錄
譯者序
第四版前言
上冊
第1章 DNA的分離及定量 1
導言 2
方案1 SDS鹼裂解法製備質粒DNA：少量製備 9
方案2 SDS鹼裂解法製備質粒DNA：大量製備 12
方案3 從革蘭氏陰性菌（如Ecolz中分離DNA 15
方案4 乙醇法沉澱DNA 17
方案5 異丙醇法沉澱DNA 21
方案6 用微量濃縮機進行核酸的濃縮和脫鹽 22
方案7 丁醇抽提法濃縮核酸 23
方案8 聚乙二醇沉澱法製備Ml3噬菌體單鏈DNA 24
方案9 Ml3噬菌體鋪平板 27
方案10 Ml3噬菌體液體培養 30
方案11 Ml3噬菌體雙鏈（複製型）DNA的製備 32
方案12 利用有機溶劑分離純化高分子質量DNA 35
方案13 用蛋白酶K和苯酚從哺乳動物細胞中分離高分子質量DNA 37
方案14 一步法同時提取細胞或組織中的DNA、RNA和蛋白質 43
方案15 從鼠尾或其他小樣本中製備基因組DNA 46
替代方案：不使用有機溶劑從鼠尾分離DNA 48
替代方案：一管法從鼠尾中分離DNA 49
方案16 快速分離酵母DNA 50
方案17 微型凝膠電泳後使用溴化乙錠(EB)估算條帶中DNA數量 52
方案18 利用Hoechst33258通過螢光分析儀估算DNA濃度 53
方案19 用PicoGreen定量溶液中的DNA 55
信息欄 56
第2章 DNA分析 62
導言 63
方案1 瓊脂糖凝膠電泳 73
方案2 瓊脂糖凝膠中DNA的染色檢測 76
方案3 聚丙烯醯胺凝膠電泳 80
方案4 聚丙烯醯胺凝膠中DNA的染色檢測 85
方案5 聚丙烯醯胺凝膠中DNA的放射自顯影檢測 86
方案6 鹼性瓊脂糖凝膠電泳 87
附加方案：鹼性瓊脂糖凝膠的放射自顯影 90
方案7 成像：放射自顯影和感光成像 91
方案8 用玻璃珠從瓊脂糖凝膠中回收DNA 96
方案9 低熔點瓊脂糖凝膠中DNA的回收：有機溶劑抽提法 98
方案10 聚丙烯醯胺凝膠中DNA片段的回收：壓碎與浸泡法 101
方案11 Southern印跡 103
方案12 Southern印跡：DNA從一塊瓊脂糖凝膠同時向兩張膜轉移 110
方案13 採用放射性標記探針對固定在膜上的核酸DNA進行Southern雜交 112
附加方案：從膜上洗脫探針 117
信息欄 119
第3章 質粒載體克隆與轉化 122
導言 123
方案1 製備和轉化感受態大腸桿菌的Hanahan方法：高效轉化策略 126
方案2 製備和轉化感受態大腸桿菌的Inoue方法：“超級感受態”細胞 131
方案3 大腸桿菌的簡單轉化：納米顆粒介導的轉化 135
替代方案：一步法製備感受態大腸桿菌：在同一溶液中轉化和儲存細菌細胞 136
方案4 電穿7L法轉化大腸桿菌 138
方案5 質粒載體克隆：定向克隆 143
方案6 質粒載體克隆：平末端克隆 145
方案7 質粒DNA的去磷酸化 148
方案8 向平末端DNA添加磷酸化銜接子/接頭 150
方案9 克隆PCR產物：向擴增DNA的末端添加限制性酶切位點 151
方案10 克隆PCR產物：平末端克隆 154
方案11 克隆PCR產物：制各T載體 157
方案12 克隆PCR產物：TA克隆 159
方案13 克隆PCR產物：TOPO TA克隆 161
方案14 使用X-Gal和IPTG篩選細菌菌落：a-互補 165
信息欄 167
第4章 Gateway重組克隆 205
導言 206
方案1 擴增Gatewav載體 210
方案2 製備可讀框入門克隆和目的克隆 213
方案3 套用多位點LR克隆反應製備目的克隆 219
信息欄 222
第5章 細菌人工染色體及其他高容量載體的套用 223
導言 224
方案1 BAC DNA的小量分離和PCR檢驗 235
方案2 BAC DNA的大量製備和線性化 238
方案3 通過脈衝電場凝膠電泳檢驗BAC DNA的質量和數量 241
方案4 兩步BAC工程：穿梭載體DNA的製備 242
方案5 A同源臂(A-Box)和B同源臂(B-Box)的製備 244
方案6 克隆A和B同源臂到穿梭載體 247
方案7 重組穿梭載體的製備和檢驗 249
方案8 通過電穿7L法轉化重組穿梭載體到感受態BAC宿主細胞 251
方案9 共合體的檢驗和重組BAC克隆的篩選 253
方案10 一步BAC修飾：質粒製備 256
方案11 A同源臂(A-Box)的製備 259
方案12 克隆A同源臂到報導穿梭載體 260
方案13 用RecA載體轉化BAC宿主 263
方案14 轉移報導載體到BACiRecA細胞以及共合體的篩選 265
方案15 釀酒酵母(S.cerevisiae)的生長和DNA製備 267
方案16 酵母DNA的小量製備 269
信息欄 270
第6章 真核細胞RNA的提取、純化和分析 275
導言 276
方案1 從哺乳動物的細胞和組織中提取總RNA 279
替代方案 從小量樣本提取RNA 281
方案2 從斑馬魚胚胎和成體中提取總RNA 282
方案3 從黑腹果蠅提取總RNA 283
方案4 從秀麗隱桿線蟲中提取總RNA 285
方案5 從釀酒酵母菌中採用熱酸酚提取總RNA 287
方案6 RNA定量和儲存 289
方案7 RNA的乙醇沉澱 295
方案8 通過無RNase的DNaseI處理去除RNA樣品中的DNA污染 297
方案9 oligo(dT)磁珠法提取poly(A)+mRNA 298
方案10 按照大小分離RNA：含甲醛的瓊脂糖凝膠電泳 308
方案11 根據分子質量大小分離RNA: RNA的尿素變性聚丙烯醯胺凝膠電泳 312
方案12 瓊脂糖凝膠中變性RNA的轄膜和固定 319
替代方案 下行毛細管轉移 323
方案13 聚丙烯醯胺凝膠的電轉移和膜固定 325
方案14 Northern雜交 327
方案15 純化RNA的點雜交和狹縫雜交 330
方案16 用核酸酶Sl對RNA作圖 342
方案17 核糖核酸酶保護分析：用核糖核酸酶和放射性標記的RNA探針對RNA作圖 349
方案18 引物延伸法分析RNA 355
信息欄 359
第7章 聚合酶鏈反應 363
導言 364
方案1 基礎PCR 375
方案2 熱啟動PCR 380
方案3 降落PCR 383
方案4 高GC含量模板的PCR擴增 385
方案5 長片段高保真PCR (IA PCR) 390
方案6 反向PCR 393
方案7 巢式PCR 397
方案8 mRNA反轉錄產物cDNA的擴增：兩步法RT-PCR 400
方案9 由mRNA的5'端進行序列的快速擴增：5'-RACE 409
方案10 由mRNA的3'端進行序列的快速擴增：3 '-RACE 416
方案11 使用PCR篩選克隆 422
信息欄 424
第8章 生物信息學 431
導言 432
方案1 使用ucsc基因組瀏覽器將基因組注釋可視化 434
方案2 使用BLAST和ClustalW進行序列比對和同源性檢索 444
方案3 使用Primer3Plus設計PCR引物 450
方案4 使用微陣列和RNA-seq進行表達序列譜分析 461
方案5 將上億短讀段定位至參考基因組上 472
方案6 識別ChIP-seq數據集中富集的區域（尋峰） 483
方案7 發現順式調控基序 495
信息欄 503
中冊
第9章 實時螢光聚合酶鏈反應定量檢測DNA及RNA 509
導言 510
方案1 實時PCR反套用引物和探針濃度的最佳化 532
方案2 製作標準曲線 537
方案3 實時螢光PCR定量檢測DNA 540
方案4 實時螢光PCR定量檢測RNA 542
方案5 實時螢光PCR實驗數據的分析和歸一化 545
信息欄 550
第10章 核酸平台技術 551
導言 552
方案1 即制微陣列 560
方案2 Round AiRoundB DNA擴增 564
方案3 核小體DNA和其他小於500bp的DNA的T7線性擴增(TIAD) 567
方案4 RNA的擴增 572
方案5 RNA的Cvanine-dUTP直接標記 578
方案6 RNA的氨基烯丙基-dUTP間接標記 581
方案7 用Klenow酶對DNA進行Cyanine-dCTP標記 583
方案8 DNA的間接標記 585
方案9 封閉自製微陣列上的多聚賴氨酸 587
方案10 自製微陣列的雜交 589
第11章 DNA測序 595
導言 596
方案1 毛細管測序質粒亞克隆的製備 620
方案2 毛細管測序之PCR產物的製備 625
方案3 循環測序反應 627
方案4 全基因組：手工文庫製備 630
方案5 全基因組：自動化的無索引文庫製備 636
附加方案 自動化的文庫製備 642
方案6 全基因組：自動化的帶索引文庫製備 644
方案7 用於Illumina測序的3kb末端配對文庫的製備 651
方案8 用於Illumina測序的8kb末端配對文庫的製備 659
附加方案 AMPure磁珠校準 671
方案9 RNA—Seq:RNA反轉錄為cDNA及其擴增 673
附加方案 RNACleanⅪ’磁珠純化/RNA—Seq前） 679
方案10 液相外顯子組捕獲 680
附加方案 AMPure XP磁珠純化 688
附加方案 瓊脂糖凝膠大小篩選 689
方案11 自動化大小篩選 690
方案12 用SYBR Green-qPCR進行文庫定量 693
方案13 用PicoGreen螢光法進行文庫DNA定量 696
方案14 文庫定量：用Qubit系統對雙鏈或單鏈DNA進行螢光定量 700
方案15 為454測序製備小片段文庫 702
方案16 單鏈DNA文庫的捕獲及emPCR 708
方案17 Rochei454測序：執行一個測序運行 714
方案18 結果有效性確認 721
方案19 測序數據的履量評估 723
方案20 數據分析 724
信息欄 725
第12章 哺乳動物細胞中DNA甲基化分析 729
導言 730
方案1 DNA亞硫酸氫鹽測序法檢測單個核苷酸的甲基化 735
方案2 甲基化特異性聚合酶鏈反應法檢測特定基因的DNA甲基化 742
方案3 基於甲基化胞嘧啶免疫沉澱技術的DNA甲基化分析 745
方案4 高通量深度測序法繪製哺乳動物細胞DNA甲基化圖譜 749
方案5 亞硫酸氫鹽轉化的DNA文庫的Roche454克隆測序 760
方案6 亞硫酸氫鹽轉化的DNA文庫的Illumina測序 765
信息欄 770
第13章 標記的DNA探針、RNA探針和寡核苷酸探針的製備 775
導言 776
方案1 隨機引物法：用隨機寡核苷酸延伸法標記純化的DNA片段 792
方案2 隨機引物法：在融化瓊脂糖存在下用隨機寡核苷酸延伸法標記DNA 798
方案3 用切口平移法標記DNA探針 800
方案4 用聚合酶鏈反應標記DNA探針 804
附加方案 不對稱探針 808
方案5 體外轉錄合成單鏈RNA探針 809
附加方案 用PCR法將噬菌體編碼的RNA聚合酶啟動子加至DNA片段上 816
方案6 用隨機寡核苷酸引物法從mRNA合成cDNA探針 818
方案7 用隨機寡核苷酸延伸法製備放射性標記的消減cDNA探針 820
方案8 用大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片段標記雙鏈DNA的3' 端 825
方案9 用鹼性磷酸酶進行DNA片段的去磷酸化 831
方案10 含5'突出羥基端的DNA分子磷酸化 833
方案11 去磷酸化的平端或5'凹端DNA分子的磷酸化 836
方案12 用T4多核苷酸激酶進行寡核苷酸5'端的磷酸化 839
方案13 用末端脫氧核苷酸轉移酶標記寡核苷酸3'端 841
替代方案 用TdT合成非放射性標記的探針 843
附加方案 加尾反應 843
附加方案 合成非放射性標記探針的修飾 844
方案14 用大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片段標記合成的寡核苷酸 845
方案15 用乙醇沉澱法純化標記的寡核苷酸 849
方案16 用空間排阻層析法純化標記的寡核苷酸 850
方案17 用Sep-PakCl8柱色譜法純化標記的寡核苷酸 852
方案18 寡核苷酸探針在水溶液中雜交： 在含季銨鹽緩衝液中洗滌 854
信息欄 857
第14章 體外誘變方法 871
尋言 872
方案1 用易錯DNA聚合酶進行隨機誘變 879
方案2 重疊延伸PCR產生插入或缺失誘變 890
方案3 以雙鏈DNA為模板的體外誘變：用DpnI選擇突變體 897
方案4 突變型B一內醯胺酶選擇法定點誘變 904
方案5 通過單一限制性位點消除進行寡核苷酸指導的誘變/USE誘變） 910
方案6 利用密碼子盒插入進行飽和誘變 915
方案7 隨機掃描誘變 922
方案8 多位點定向誘變 926
方案9 基於PCR的大引物誘變 930
信息欄 933
第15章 向培養的哺乳動物細胞中導入基因 937
導言 938
方案1 陽離子脂質試劑介導的DNA轉染 942
替代方案 採用DOTMA和DOGS進行轉染 948
附加方案 單層細胞組織化學染色檢測B一半乳糖苷酶 950
方案2 磷酸鈣介導的質粒DNA轉染真核細胞 952
替代方案 磷酸鈣介導的質粒DNA高效轉染真核細胞 956
方案3 磷酸鈣介導的高分子質量基因組DNA轉染細胞 959
替代方案 磷酸鈣介導的貼壁細胞的轉染 962
替代方案 磷酸鈣介導的懸浮生長細胞的轉染 963
方案4 DEAE-葡聚糖介導的轉染：高效率的轉染方法 964
替代方案 DEAE-葡聚糖介導的轉染：提高細胞活力的方案 966
方案5 電穿孑L轉染DNA 968
方案6 通過alamarBlue法分析細胞活力 972
方案7 通過乳酸脫氫酶法分析細胞活力 974
方案8 通過MTT法分析細胞活力 977
信息欄 980
第16章 向哺乳動物細胞中導入基因：病毒載體 998
導言 999
方案1 直接克隆法構建重組腺病毒基因組 1 019
方案2 將克隆的重組腺病毒基因組釋放用於挽救和擴增 1023
方案3 氯化銫梯度沉降法純化重組腺病毒 1028
方案4 限制性內切核酸酶消化法鑑定純化後的重組腺病毒基因組 1031
方案5 TCID50終點稀釋結合qPCR測定重組腺病毒感染滴度 1034
附加方案 準備qPCR的DNA標準品 1042
方案6 濃縮傳代和Real-Time qPCR法檢測有複製能力腺病毒(RCA) 1043
方案7 瞬時轉染法製備rAAV 1051
方案8 氯化銫梯度沉降法純化rAAV 1054
方案9 碘克沙醇梯度離心法純化rAAV 1059
方案10 肝素親和層析法純化rAAV2 1062
方案11 陰離子交換柱層析法從碘克沙醇梯度離心後的rAAV樣本中富集完全包裝病毒 1065
方案12 實時定量PCR法測定rAAV基因組拷貝數 1068
方案13 TCID50終點稀釋結合qPCR法靈敏測定rAAV惑染滴度 1071
方案14 負染色法和高分辨電子顯微鏡分析rAAV樣本形態 1074
方案15 銀染SDS-PAGE分析rAAV純度 1076
方案16 高滴度反轉錄病毒和慢病毒載體的製備 1079
方案17 慢病毒載體的滴定 1085
方案18 監測慢病毒載體儲備液中的可複製型病毒 1089
信息欄 1091
下冊
第17章 利用報導基因系統分析基因表達調控 1102
導言 1103
方案1 哺乳動物細胞提取物中B一半乳糖苷酶的測定 1112
附加方案 化學發光實驗檢測B一半乳糖苷酶活性 1115
方案2 單螢光素酶報導基因實驗 1118
方案3 雙螢光素酶報導基因實驗 1123
方案4 酶聯免疫吸附試驗定量檢測綠色螢光蛋白 1128
方案5 用四環素調控基因表達建立細胞系 1131
附加方案 有限稀釋法篩選懸浮細胞的穩定克隆 1138
信息欄 1140
第18章 RNA干擾與小RNA分析 1170
導言 1171
方案1 雙鏈siRNA製備 1185
方案2 通過轉染雙鏈siRNA在哺乳動物細胞中進行RNA干擾 1187
方案3 通過轉染雙鏈siRNA在果蠅S2細胞中進行RNA干擾 1190
方案4 體外轉錄法製備dsRNA 1192
方案5 採用dsRNA浸泡果蠅S2細胞進行RNA干擾 1196
方案6 採用dsRNA轉染在果蠅S2細胞中進行RNA干擾 1198
方案7 小RNA的Northern雜交分析 1199
方案8 反轉錄定量PCR分析小RNA 1203
方案9 構建小RNA高通量測序文庫 1206
方案10 抑制miRNA功能的反義寡核苷酸製備 1215
方案11 在哺乳動物細胞中通過反義寡核苷酸抑制miRNA功能 1216
方案12 在果蠅S2細胞中通過反義寡核苷酸抑制miRNA功能 1218
信息欄 1219
第19章 克隆基因的表達以及目的蛋白的純化和分析 1225
導言 1226
方案1 在大腸桿菌中利用可用IPTG誘導的啟動子表達克隆化基因 1249
附加方案 目標蛋白可溶性表達的小量試驗 1255
替代方案 在大腸桿菌中利用阿拉伯糖BAD啟動子表達克隆基因 1260
替代方案 信號肽融合雖白的亞細胞定位 1261
方案2 用桿狀病毒表達系統表達克隆基因 1265
附加方案 噬菌斑測定法確定桿狀病毒原液的滴度 1271
替代方案 用於轉染昆蟲細胞的桿粒DNA製備 1274
方案3用 甲醇誘導啟動子AOX1在畢赤酵母中表達克隆基因 1277
附加方案 酵母培養物的凍存 1287
方案4 用於純化大腸桿菌中表達可溶性蛋白的細胞提取物的製備 1291
附加方案 酵母細胞玻璃珠裂解法 1296
替代方案 溫和的熱誘導的酶裂解法製備大腸桿菌細胞提取物 1298
替代方案 用溶菌酶裂解和凍融法聯用製備大腸桿菌細胞提取物 1300
方案5 採用固化的金屬親和層析純化多聚組氨酸標記的蛋白質 1302
附加方案 Niz+-NTA樹脂的清洗與再生 1309
替代方案 組氨酸標籤蛋白的快速液相色譜純化 1310
方案6 採用谷胱甘肽樹脂以親和層析純化融合蛋白 1314
方案7 包含體中表達蛋白的增溶 1321
方案8 蛋白質的SDS-PAGE 1325
替代方案 用考馬斯亮藍進行SDS-PAGE凝膠染色的各種不同方法 1335
替代方案 用銀鹽進行SDS-PAGE凝膠染色 1336
方案9 蛋白質的免疫印跡分析 1340
方案 10測定蛋白質濃度的方法 1347
信息欄 1353
第20章 利用交聯技術分析染色質結構與功能 1358
導言 1359
方案1 甲醛交聯 1369
方案2 製備用於染色質免疫沉澱的交聯染色質 1371
方案3 染色質免疫沉澱(ChIP) 1373
方案4 染色質免疫沉澱-定量聚合酶鏈反應( ChIP-qPCR) 1377
方案5 染色質免疫沉澱-晶片雜交（ChIP-chip） 1378
方案6 染色質免疫沉澱-高通量測序(ChIP-seq) 1385
方案7 交聯細胞3C文庫的製備 1389
方案8 環形染色質免疫沉澱（ChIP-loop）文庫的製備 1393
方案9 連線產物對照組文庫的製備 1398
方案10 PCR檢測3C、ChIP-loop和對照文庫中的3C連線產物：文庫滴定與相互作用頻率分析 1400
方案11 3C、ChIP-loop和對照組文庫的4C分析 1404
方案12 3C、ChIP-loop和對照組文庫的5C分析 1408
信息欄 1412
第21章 紫外交聯免疫沉澱(CLIP)技術進行體內RNA結合位點作圖 1415
導言 1416
方案1 CLIP實驗免疫沉澱嚴謹性的最佳化 1424
方案2 活細胞的紫外交聯和裂解物製備 1429
方案3 RNA酶滴定、免疫沉澱及SDS-PAGE 1432
方案4 3'-接頭的連線祁用SDS-PAGE進行大小選擇 1441
替代方案 去磷酸化RL3接頭5端的標記 1445
方案5 RNA標籤的分離、5二接頭的連線和反轉錄PCR擴增 1446
方案6 RNA CLIP標籤測序 1456
方案7 RNA接頭膠回收及保存 1458
信息欄 1460
第22章 Gateway相容酵母單雜交和雙雜交系統 1464
導言 1465
方案1 構建酵母單雜交DNA-誘餌菌株 1474
替代方案 用復性引物從DNA誘餌中獲得入門克隆產物 1481
方案2 生成酵母雙雜交DB-誘餌菌株 1484
方案3 從活化域捕獲文庫中鑑定相互作用分子 1490
方案4 高效的酵母轉化 1496
方案5 用於B-半乳糖苷酶活力的菌落轉移比色測定 1500
方案6 酵母克隆的PCR 1502
信息欄 1504
附錄1 試劑和緩衝液 1507
附錄2 常用技術 1533
附錄3 檢測系統 1541
附錄4 一般安全原則和危險材料 1565
索引 1573
