高產突變體
突變體就是Ser236位於橫貫枯草蛋白酶E的α-螺旋末端,遠離催化活性中心,Ser236的突變不會對酶的活性產生大的影響。用定點突變的方法對枯草蛋白酶E的基因進行改造引入Ser236Cys,可能會形成分子間二硫鍵,有利於提高酶的穩定性。Ser236Cys變化酶(BP-1)活性是野生型蛋白酸E的1.5倍,熱穩定性提高3倍;進一步在其他位點引入突變的變體酶BU-1(Ala15Asp/Gly20His/Ser23)。
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離子注入Vc生產菌及高產突變體的產業化研究
維生素C是我國醫藥行業兩大出口創匯的龍頭產品之一,連續十六年位居國內醫藥業出口創匯之首,但多年來Vc生產技術,尤其是菌種發酵水平一直徘徊不前,在日趨激烈的國際市場競爭面前,如何提高Vc生產的技術水平顯得十分緊迫而意義重大。
通過離子注入Vc生產菌生物學效應的初步研究,對比H+、N+、Ar+注入、UV輻照的結果,結合對Vc生產二步混合菌的生長特性、發酵規律的研究,制定了最佳誘變方案,確定了最佳注入離子和最適注入劑量。
經多層次組合式離子注入和大量篩選,獲得若干Vc高產突變菌株,其糖酸克分之轉化率達94%,較出發菌提高10個百分點以上,隨後對高產突變菌株的遺傳穩定性及影響產酸的因素進行了研究。在此基礎上進行了Vc耐高溫高產突變菌株的篩選,經過多輪離子注入和耐高溫馴化,篩選出兩組高溫組合菌,經發酵實驗,在溫度提高到33℃的情況下,產酸可達96%。
隨後,Vc高產菌株成功轉讓給東北製藥總廠和江蘇江山製藥有限公司,並順利完成工業化生產實驗,全面投入生產。在180噸和300噸發酵罐上平均糖酸轉化率在92%,最高可達97%,每年可為企業淨增利潤5000萬元,為國家多創1000萬美元的外匯。
Vc“葡萄糖一步發酵法”將使Vc生產產生革命性的變化,國內外都在攻克這一科學技術難題。本論文提出葡萄糖一步發酵新的途徑,並就此展開了卓有成效的研究工作,在投糖4%的情況下,對葡萄糖-古龍酸的轉化率達58.6%,居國內外領先水平。
基於離子注入對細胞的刻蝕效應,開展了離子束介導微生物外源DNA的轉導,首次建立了離子注入介導微生物外源DNA轉導的研究體系,在此指導下成功的獲得兩株轉基因生物工程菌,並利用分子生物學方法對轉基因菌的遺傳背景進行了分析。