前 言
本標準代替GB/T5009.128—2003《食品中膽固醇的測定》 、GB/T22220—2008《食品中膽固醇的測定 高效液相色譜法》和GB/T9695.24—2008《肉與肉製品 膽固醇含量測定》。
本標準與GB/T5009.128—2003相比,主要變化如下:
———標準名稱修改為“食品安全國家標準食品中膽固醇的測定”;
———增加了氣相色譜法作為第一法,高效液相色譜法作為第二法;比色法改為第三法;
———修改了GB/T9695.24—2008氣相色譜法的前處理方法中提取溶劑、無水乙醇的添加量和定容體積。
範圍
本標準規定了食品中膽固醇的測定方法。
本標準適用於食品中膽固醇的測定,第一法氣相色譜法適用於肉及肉製品、蛋及蛋製品、乳及乳製品等各類動物性食品以及植物油脂中膽固醇的測定;第二法高效液相色譜法適用於肉及肉製品、蛋及蛋製品、乳及乳製品等各類動物性食品中膽固醇的測定;第三法比色法適用於肉及肉製品、蛋及蛋製品等動物性食品中膽固醇的測定。
氣相色譜法
原理
樣品經無水乙醇-氫氧化鉀溶液皂化,石油醚和無水乙醚混合提取,提取液濃縮至乾,無水乙醇溶解定容後,採用氣相色譜法檢測,外標法定量。
試劑和材料
除非另有說明,本方法所用試劑均為分析純,水為GB/T6682規定的一級水。
試劑
甲醇(CH3OH):色譜純。
無水乙醇(C2H5OH)。
石油醚:沸程30℃~60℃。
無水乙醚(C4H10O)。
無水硫酸鈉(Na2SO4)。
氫氧化鉀(KOH)。
1.甲醇(CH3OH):色譜純。
2.無水乙醇(C2H5OH)。
3.石油醚:沸程30℃~60℃。
4.無水乙醚(C4H10O)。
5.無水硫酸鈉(Na2SO4)。
6.氫氧化鉀(KOH)。
試劑配製
60%氫氧化鉀溶液:稱取60g氫氧化鉀,緩慢加水溶解,並定容至100mL。
石油醚-無水乙醚混合液(1+1,體積比):將石油醚和無水乙醚等體積混合均勻。
標準品
膽固醇標準品(C27H46O,CAS號:57-88-5):純度≥99%。
標準溶液配製
膽固醇標準儲備液(1.0mg/mL)
稱取膽固醇標準品0.05g(精確至0.1mg),用無水乙醇溶解並定容至50mL,放置0℃~4℃密封可貯藏半年。
膽固醇標準系列工作液
分別吸取標準儲備液(1.0mg/mL)25μL、50μL、100μL、500μL、2000μL,用無水乙醇定容至10mL,該標準系列工作液的濃度分別為2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、50μg/mL、200μg/mL。現用現配。
儀器和設備
氣相色譜儀:配有氫火焰離子化檢測器(FID)。
電子天平:感量為1mg和0.1mg。
勻漿機。
皂化裝置。
1.氣相色譜儀:配有氫火焰離子化檢測器(FID)。
2.電子天平:感量為1mg和0.1mg。
3.勻漿機。
4.皂化裝置。
分析步驟
試樣製備
肉及肉製品等各類固體試樣
取樣品的可食部分200g進行均質。將試樣裝入密封的容器里,防止變質和成分變化。試樣應在均質化24h內儘快分析。
植物油脂、乳品等液體試樣
取混勻後的均勻液體試樣裝入密封容器里待測。
樣品處理
皂化
稱取製備後的樣品0.25g~10g(準確至0.001g,膽固醇含量約為0.5mg~5mg),於250mL圓底燒瓶中,加入30mL無水乙醇,10mL60%氫氧化鉀溶液,混勻。將試樣在100℃磁力攪拌加熱電熱套皂化回流1h,不時振盪防止試樣黏附在瓶壁上,皂化結束後,用5mL無水乙醇自冷凝管頂端沖洗其內部,取下圓底燒瓶,用流水冷卻至室溫。
提取
定量轉移全部皂化液於250mL分液漏斗中,用30mL水分2次~3次沖洗圓底燒瓶,洗液併入分液漏斗,再用40mL石油醚-無水乙醚混合液(1+1,體積比)分2次~3次沖洗圓底燒瓶併入分液漏斗,振搖2min,靜置,分層。轉移水相,合併三次有機相,用水每次100mL洗滌提取液至中性,初次水洗時輕輕旋搖,防止乳化,提取液通過約10g無水硫酸鈉脫水轉移到150mL平底燒瓶中。
濃縮
將上述平底燒瓶中的提取液在真空條件下蒸發至近乾,用無水乙醇溶解並定容至5mL,待氣相色譜儀測定。
不同試樣的前處理需要同時做空白試驗。
測定
儀器參考條件
色譜柱:DB-5彈性石英毛細管柱,柱長30m,內徑0.32mm,粒徑0.25μm,或同等性能的色譜柱;
載氣:高純氮氣,純度≥99.999%;恆流2.4mL/min;
柱溫(程式升溫):初始溫度為200℃,保持1min,以30℃/min速率升至280℃,保持10min;
進樣口溫度280℃;
檢測器溫度:290℃;
進樣量:1μL;
進樣方式:不分流進樣,進樣1min後開閥;
空氣流量:350mL/min;
氫氣流量:30mL/min。
1.色譜柱:DB-5彈性石英毛細管柱,柱長30m,內徑0.32mm,粒徑0.25μm,或同等性能的色譜柱;
2.載氣:高純氮氣,純度≥99.999%;恆流2.4mL/min;
3.柱溫(程式升溫):初始溫度為200℃,保持1min,以30℃/min速率升至280℃,保持10min;
4.進樣口溫度280℃;
5.檢測器溫度:290℃;
6.進樣量:1μL;
7.進樣方式:不分流進樣,進樣1min後開閥;
8.空氣流量:350mL/min;
9.氫氣流量:30mL/min。
標準曲線的製作
分別取膽固醇標準系列工作液注入氣相色譜儀,在上述色譜條件下測定標準溶液的回響值(峰面積),以濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標,製作標準曲線。
測定
試樣溶液注入氣相色譜儀,測定峰面積,由標準曲線得到試樣溶液中膽固醇的濃度。根據保留時間定性,外標法定量。膽固醇標準溶液的色譜圖見圖A.1。
分析結果的表述
試樣中膽固醇的含量按式(1)計算:
食品中膽固醇的測定…………………………(1)
式中:
X ———試樣中膽固醇含量,單位為毫克每百克(mg/100g);
ρ ———試樣溶液中膽固醇的濃度,單位為微克每毫升(μg/mL);
V ———試樣溶液最終定容的體積,單位為毫升(mL);
m ———試樣質量,單位為克(g);
1000、100———換算係數。
計算結果應扣除空白。結果保留三位有效數字。
精密度
在重複性條件下獲得的兩次獨立測定結果的絕對差值不得超過算術平均值的10%。
其他
當稱樣量為0.5g,定容體積為5.0mL,方法的檢出限為0.3mg/100g,定量限為1.0mg/100g。
高效液相色譜法
原理
樣品經無水乙醇-氫氧化鉀溶液皂化,石油醚和無水乙醚混合提取,提取液濃縮至乾,無水乙醇溶解定容後,採用高效液相色譜儀檢測,外標法定量。
試劑和材料
除非另有說明,本方法所用試劑均為分析純,水為GB/T6682規定的一級水。
試劑
甲醇(CH3OH):色譜純。
無水乙醇(C2H5OH)。
石油醚:沸程30℃~60℃。
無水乙醚(C4H10O)。
無水硫酸鈉(Na2SO4)。
氫氧化鉀(KOH)。
1.甲醇(CH3OH):色譜純。
2.無水乙醇(C2H5OH)。
3.石油醚:沸程30℃~60℃。
4.無水乙醚(C4H10O)。
5.無水硫酸鈉(Na2SO4)。
6.氫氧化鉀(KOH)。
試劑配製
60%氫氧化鉀溶液:稱取60g氫氧化鉀,緩慢加水溶解,並定容至100mL。
石油醚-無水乙醚混合液(1+1,體積比):將石油醚和無水乙醚等體積混合均勻。
標準品
膽固醇標準品(C27H46O,CAS號:57-88-5):純度≥99%。
標準溶液配製
膽固醇標準儲備液(1.0mg/mL):稱取膽固醇標準品0.05g(精確至0.1mg),用無水乙醇溶解並定容至50mL,放置0℃~4℃密封可貯藏半年。
膽固醇標準系列工作液:分別吸取標準儲備液(1.0mg/mL)25μL、50μL、100μL、500μL、2000μL,用無水乙醇定容至10mL,該標準系列工作液的濃度分別為2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、50μg/mL、200μg/mL。現用現配。
儀器和設備
勻漿機。
高效液相色譜儀:配有紫外檢測器或相當的檢測器。
電子天平:感量為1mg和0.1mg。
分析步驟
試樣製備
肉及肉製品等各類固體試樣
樣品取可食部分200g,使用絞肉機或勻漿機將試樣均質。將試樣裝入密封的容器里,防止變質和成分變化。試樣應在均質化24h內儘快分析。
乳品等液體試樣
取混勻後的均勻液體試樣裝入密封容器里待測。
樣品處理
皂化
稱取製備後的樣品0.25g~10g(精確至0.001g,膽固醇含量約為0.5mg~5mg),於250mL圓底燒瓶中,加入30mL無水乙醇,10mL60%氫氧化鉀溶液,混勻。將試樣在100℃磁力攪拌加熱電熱套皂化回流1h,不時振盪防止試樣黏附在瓶壁上,皂化結束後,用5mL無水乙醇自冷凝管頂端沖洗其內部,取下圓底燒瓶,用流水冷卻至室溫。
提取
定量轉移全部皂化液於250mL分液漏斗中,用30mL水分2次~3次沖洗圓底燒瓶,洗液併入分液漏斗,再用40mL石油醚-無水乙醚混合液(1+1,體積比)分2次~3次沖洗圓底燒瓶併入分液漏斗,振搖2min,靜置,分層。轉移水相,合併三次有機相,用水每次100mL洗滌提取液至中性,初次水洗時輕輕旋搖,防止乳化,提取液通過約10g無水硫酸鈉脫水轉移到150mL平底燒瓶中。
濃縮
將上述平底燒瓶中的提取液在真空條件下蒸發至近乾,用無水乙醇溶解並定容至5mL,溶液通過0.45μm 過濾膜,收集濾液於進樣瓶中,待高效液相色譜儀測定。
不同試樣的前處理需要同時做空白試驗。
測定
儀器參考條件
色譜柱:C18反相色譜柱,柱長4.6mm,內徑150mm,粒徑5μm,或同等性能的色譜柱;
柱溫:38℃;
流動相:甲醇;
流速:1.0mL/min;
測定波長:205nm;
進樣量:10μL。
1.色譜柱:C18反相色譜柱,柱長4.6mm,內徑150mm,粒徑5μm,或同等性能的色譜柱;
2.柱溫:38℃;
3.流動相:甲醇;
4.流速:1.0mL/min;
5.測定波長:205nm;
6.進樣量:10μL。
標準曲線的製作
分別取10μL膽固醇標準工作液注入高效液相色譜儀,在上述色譜條件下測定標準溶液的回響值(峰面積),以濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標,製作標準曲線。
測定
將10μL試樣溶液注入高效液相色譜儀,測定峰面積,由標準曲線得到試樣溶液中膽固醇的濃度。
膽固醇標準溶液的色譜圖見圖A.2。
分析結果的表述
試樣中膽固醇的含量按式(2)計算:
食品中膽固醇的測定…………………………(2)
式中:
X ———試樣中膽固醇的含量,單位為毫克每百克(mg/100g);
ρ ———試樣溶液中膽固醇的濃度,單位為微克每毫升(μg/mL);
V ———試樣溶液定容體積,單位為毫升(mL);
m ———試樣質量,單位為克(g);
1000、100———換算係數。
計算結果應扣除空白。結果保留三位有效數字。
精密度
在重複性條件下獲得的兩次獨立測定結果的絕對差值不得超過算術平均值的10%。
其他
當稱樣量為1g,定容體積為5mL,方法的檢出限為0.64mg/100g,定量限為2.1mg/100g。
比色法
原理
樣品進行脂肪提取後的油脂,經無水乙醇-氫氧化鉀溶液皂化,用石油醚提取,濃縮後加入冰乙酸,以硫酸鐵銨試劑作為顯色劑,採用分光光度計,在560nm~575nm 波長下檢測,外標法定量。
試劑和材料
除非另有說明,本方法所用試劑均為分析純,水為GB/T6682規定的三級水。
試劑
無水乙醇(C2H5OH)。
石油醚:沸程30℃~60℃。
硫酸(H2SO4)。
冰乙酸(C2H4O2):優級純。
磷酸(H3PO4)。
硫酸鐵銨[FeNH4(SO4)2·H2O]。
鋼瓶氮氣(N2):純度99.99%。
海砂。
氫氧化鉀(KOH)。
氫氧化鈉(NaOH)。
鹽酸(HCl)。
乙醚(C2H5O)。
1.無水乙醇(C2H5OH)。
2.石油醚:沸程30℃~60℃。
3.硫酸(H2SO4)。
4.冰乙酸(C2H4O2):優級純。
5.磷酸(H3PO4)。
6.硫酸鐵銨[FeNH4(SO4)2·H2O]。
7.鋼瓶氮氣(N2):純度99.99%。
8.海砂。
9.氫氧化鉀(KOH)。
10.氫氧化鈉(NaOH)。
11.鹽酸(HCl)。
12.乙醚(C2H5O)。
試劑配製
鐵礬儲備液:稱取4.463g硫酸鐵銨[FeNH4(SO4)2·H2O]於100mL磷酸中(如果不能充分溶解,超聲後取上清液),貯藏於乾燥器內,此液在室溫中穩定。
鐵礬顯色液:吸取鐵礬儲備液10mL,用硫酸定容至100mL。貯藏於乾燥器內,以防吸水。
50%氫氧化鉀溶液:稱取50g氫氧化鉀,用水溶解,並定容至100mL。
5%氯化鈉溶液:稱取5g氯化鈉,用水溶解,並定容至100mL。
鹽酸溶液(1+1):將鹽酸與水等體積混合均勻。
氫氧化鈉溶液(240g/L):稱取24g氫氧化鈉,用水溶解並定容至100mL。
海砂:取用水洗去泥土的海砂或河砂,先用鹽酸溶液(1+1)煮沸0.5h,用水洗至中性再用氫氧化鈉溶液(240g/L)煮沸0.5h,用水洗至中性,經100℃±5℃乾燥備用。
1.鐵礬儲備液:稱取4.463g硫酸鐵銨[FeNH4(SO4)2·H2O]於100mL磷酸中(如果不能充分溶解,超聲後取上清液),貯藏於乾燥器內,此液在室溫中穩定。
2.鐵礬顯色液:吸取鐵礬儲備液10mL,用硫酸定容至100mL。貯藏於乾燥器內,以防吸水。
3.50%氫氧化鉀溶液:稱取50g氫氧化鉀,用水溶解,並定容至100mL。
4.5%氯化鈉溶液:稱取5g氯化鈉,用水溶解,並定容至100mL。
5.鹽酸溶液(1+1):將鹽酸與水等體積混合均勻。
6.氫氧化鈉溶液(240g/L):稱取24g氫氧化鈉,用水溶解並定容至100mL。
7.海砂:取用水洗去泥土的海砂或河砂,先用鹽酸溶液(1+1)煮沸0.5h,用水洗至中性再用氫氧化鈉溶液(240g/L)煮沸0.5h,用水洗至中性,經100℃±5℃乾燥備用。
標準品
膽固醇標準品(C27H46O,CAS號:57-88-5):純度≥99%。
標準溶液配製
膽固醇標準儲備液(1.0mg/mL):稱取膽固醇標準品0.10g(精確至0.1mg),用冰乙酸溶解並定容至100mL。放置4℃密封可貯藏半年。
膽固醇標準工作液(100μg/mL):吸取膽固醇標準儲備液(1.0mg/mL)10mL,用冰乙酸定容至100mL。現用現配。
儀器和設備
勻漿機。
分光光度計。
電子天平:感量為1mg和0.1mg。
分析步驟
膽固醇標準曲線的製作
吸取膽固醇標準工作液0.0mL、0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL分別置於10mL試管中,在各管內加入冰乙酸使總體積均達4mL。沿管壁加入2mL鐵礬顯色液,混勻,在15min~90min內,在560nm~575nm 波長下比色。以膽固醇標準濃度為橫坐標,吸光度為縱坐標製作標準曲線。
測定
食品中脂肪的提取與測定
根據食品種類分別用索氏脂肪提取法,研磨浸提法和羅高氏法提取脂肪。並計算出每100g食品中的脂肪含量。
食品中膽固醇的測定
將提取的油脂3滴~4滴(約含膽固醇300μg~500μg),置於25mL試管中,準確記錄其質量。加入4mL無水乙醇,0.5mL50%氫氧化鉀溶液,混勻,裝上冷凝管,在65 ℃恆溫水浴鍋中皂化1h。皂化時每隔20min~30min振搖一次使皂化完全。皂化完畢,取出試管,用流水冷卻。加入3mL5%氯化鈉溶液,10mL石油醚,蓋緊玻璃塞,在電動振盪器上振搖2min,靜置分層(一般約需1h以上)。取上層石油醚液2mL,置於10mL具塞玻璃試管內,在65℃水浴中用氮氣吹乾,加入4mL冰乙酸,2mL鐵礬顯色液,混勻,放置15min後在560nm~575nm 波長下比色,測得吸光度,在標準曲線上查出相應的膽固醇含量。
不同試樣的前處理需要同時做空白試驗。
分析結果的表述
試樣中膽固醇的含量按式(3)計算:
食品中膽固醇的測定…………………………(3)
式中:
X ———試樣中膽固醇含量,單位為毫克每百克(mg/100g);
A ———測得的吸光度值在膽固醇標準曲線上的膽固醇含量,單位為微克(μg);
C ———試樣中脂肪含量,單位為克每百克(g/100g);
V1 ———石油醚總體積,單位為毫升(mL);
V2 ———取出的石油醚體積,單位為毫升(mL);
m ———稱取食品油脂試樣量,單位為克(g);
1000———換算係數。
計算結果應扣除空白。結果保留三位有效數字。
精密度
在重複性條件下獲得的兩次獨立測定結果的絕對差值不得超過算術平均值的10%。
其他
方法的檢出限為2.4mg/100g,定量限為7.2mg/100g。
附 錄 A
膽固醇標準溶液的氣相色譜圖
見圖A.1。
圖A.1 膽固醇標準溶液的氣相色譜圖膽固醇標準溶液的高效液相色譜圖
見圖A.2。
圖A.2 膽固醇標準溶液的高效液相色譜圖