原理
以紅血球為載體的間接凝集反應叫做間接血凝。將抗原吸附在紅血球上用以檢測微量抗體稱為正向間接血凝，以抗體吸附於紅血球上，檢測相應的抗原，稱為反向間接血凝。
用抗原吸附紅血球，一般比較容易，但用免疫血清吸附紅血球，則困難得多，而且往往不易獲得良好的結果，因為免疫血清中的成分非常複雜。許多其他蛋白質和非抗體活性的免疫球蛋白占據紅血球的表面，而影響血球的特異性凝集。
材料與試劑
1．紅血球
2．反應板分聚苯乙烯塑膠板和有機玻璃板（聚甲基丙烯酸甲酯），每板又有96孔和72孔兩種規格。按孔型又可分為V和U型兩種，V型具有更典型的凝集模型，U型有時比V型的血清效價高1～2孔。反應板不能煮沸消毒和浸泡於來蘇兒水中。消毒可用0.5%甲醛溶液，1%新潔爾滅及紫外線照射等。
3．稀釋棒由合金製成。棒頭有8條溝，吸液量為0.025ml，通過火焰，使表面氧化變粗易於吸取液體。它的作用是蘸取、轉移、混合液體。為了長期保持棒頭的氧化層，每使用20次左右，應過火焰一次。
4．標準滴管每滴0.025ml。
5．微型振盪器
6．兔血清鹽水作為穩定劑，用於懸浮致敏紅血球以及稀釋供試血清。製法為：無菌採取兔血，收集血清，滅活後4℃保存。同時，取所需量加4倍量的2.5%血球懸液，混勻，37℃水浴10min，以吸附異嗜性凝集素，離心後取上清；再以pH7.2PBS稀釋成1%兔血清鹽水，冰櫃保存可供數日內之用。
7．抗原儘可能使用高純度的抗原。
8．供試血清或其它含抗體材料供試血清必須滅活，加9倍2.5%的紅血球懸液，37℃水浴10min～20min，進行吸收，然後離心，取上清，即為1:10的血清稀釋液。
9．醛化劑甲醛、戊二醛、丙酮醛等。
10．優質鞣酸
11．0.15Mol/L pH6.4PBS液，用於紅血球致敏。
12．0.15Mol/L pH7.2PBS液，用於一般稀釋液。
13．0.02%牛血清白蛋白PBS液
14．生理鹽水
紅血球的處理
1．新鮮紅血球新鮮紅血球用阿氏液保存於4℃，可供3周內使用。採用新鮮紅血球做凝集反應，模型新鮮，典型，而且敏感性也比醛化紅血球高出1～2個滴度。但用新鮮紅血球致敏後，保存時間短，而且不同動物個體和不同批次來源的紅血球均有差異，影響試驗結果和分析。為了克服這一缺點，多採用醛化紅血球或鞣化紅血球。
2．紅血球醛化極其優點
（1）醛化方法：常見的醛化劑有甲醛、戊二醛和丙酮醛。
甲醛醛化過程：①將紅血球用pH7.2PBS反覆洗滌4次，以除去血清蛋白以及紅血球表面的膠體物質；②按1︰8的比例取紅血球（壓積）和3%甲醛液（用pH7.2PBS稀釋，預先冷卻至4℃），緩慢混合，加膠塞4℃作用24h，不時搖動；③傾去上清液，再以1︰2（V/V）加入36%～38%冷的（10℃）甲醛溶液，混勻，再放入4℃24h；④⑷離心去上清，以生理鹽水反覆洗滌4次。徹底清除甲醛液，最後以生理鹽水配成10%懸液甲醛化紅血球，加1/萬硫柳汞防腐，4℃保存。
戊二醛醛化過程：①取新鮮紅血球，以生理鹽水洗滌4次；②以0.15Mol/L pH 7.2 PBS配成1%戊二醛溶液，4℃保存備用；③將100ml 1%冰冷的戊二醛液加入到10ml～15ml紅血球中，邊加邊攪拌（也可置電磁攪拌器上）30min；④離心去上清，以生理鹽水洗滌4次，最後以PBS液（或生理鹽水）配成10%懸液，加1/萬硫柳汞，4℃保存。
丙酮醛—甲醛雙醛化過程：①取新鮮紅血球，洗滌4次，配成8%的懸液；②於紅血球懸液中加等量的3%丙酮醛室溫電磁攪拌16h～18h；③洗滌5次，再配成8%的懸液；④於紅血球懸液中加等量的3%甲醛，電磁攪拌16h～18h；⑤洗滌5次，最後以pH 7.2 PBS配成10%的懸液，加1/萬硫柳汞防腐，4℃保存。
（3）醛化紅血球的優點：①性質穩定，不影響紅血球表面的吸附能力；②重複性好，易標準化。③可較長期保存，醛化後4℃保存，有效期可至1年，如凍乾保存，有效期則更長。
（4）影響醛化的因素：①紅血球的潔淨程度：由於紅血球表面殘留血漿蛋白和其它膠質，易引起自家凝集，所以一定要充分洗淨；②紅血球的濃度：醛化時應儘量使紅血球稀釋度低一些，以減少紅血球的凝集和變形；③醛化時的溫度與醛化紅血球的質量有很大關係，一般認為最好是37℃。但有人認為應於4℃進行醛化；④醛化劑的濃度和醛化次數：醛化劑的濃度過大，易引起紅血球皺褶，濃度過低，又會增加溶血機會，所以一般以3%醛化濃度為宜。家禽紅血球一般醛化1～2次即可，而哺乳動物紅血球醛化2次比醛化1次要好，敏感性高，保存時間也長。不同的雙醛化，其抗原致敏作用有所不同。
表各種雙醛化紅細胞的結果比較
| 雙醛化 | 上海第六 人民醫院 | 首都 醫院 | 國外 資料 | ||||
| 抗原滴度 | 抗原滴度 | 脈衝/min | 抗原滴度 | 脈衝/min | |||
| 丙酮醛+甲醛 戊二醛+丙酮醛 丙酮醛+戊二醛 | 2 2 2 | 2 － － | 5107～5118 － － | 2×10 6×10 6×10 | 1684 2154 3750 | ||
脈衝/min是I標記的特異性抗體結合到細胞上的指標，脈衝數越大，結合抗體量也越多。但是從表5－1中可以看出結合量同可測出的抗原滴度是不平行的。
適當的振盪可使醛化劑與紅血球充分接觸，並可排除凝塊形成。但過分地振盪，則易產生氣泡，引起紅血球變形。
3．紅血球鞣化多糖、脂多糖、類脂等一些半抗原易於吸附紅血球表面，所以一般醛化處理即可。但對於許多蛋白質抗原，由於不易吸附於紅血球表面，所以在醛化的基礎上，必須再以一定濃度的鞣酸進行處理，強化它對蛋白質的吸附能力。
有人認為雙醛化後可不必進行鞣化。首都醫院做了“丙酮醛+甲醛+鞣化”和不加鞣化得出相同的抗原滴度。但多數意見認為醛化後仍需鞣化比較好。
(1)鞣化過程：①將10%醛化紅血球用生理鹽水洗滌2次，再以0.15Mol/L pH7.2PBS洗滌1次，最後以PBS配成2.50%懸液；②稱取優質鞣酸20mg，以生理鹽水4ml配成1﹕200的濃度，於37℃水浴，使之充分溶解，然後再以pH7.2PBS稀釋成1﹕2 000的濃度。當天配製、當天用完；③1份2.5%紅血球懸液與1份1﹕2 000鞣酸液充分混合，37℃水浴10min，1 500r/min離心，去上清，用PBS液洗滌1次；④以0.02%牛血清白蛋白PBS液洗滌1次，最後以牛血清白蛋白PBS配成2.5%鞣化紅血球。
（2）影響鞣化的因素：①鞣酸的質量：這是很重要的，所以必須採用優質鞣酸。分析純的鞣酸呈麵包屑狀，不呈麵粉狀，有折光性；②鞣酸的濃度：濃度過高，可以出現紅血球的凝集現象；濃度過低，達不到紅血球的活化作用。醛化過的紅血球所採用的鞣酸濃度一般比新鮮紅血球高10倍。通常以1：2 000為佳；③鞣化時間：鞣化過程一般10min～15min即可完成。時間再長也不能吸附更多的抗原，提高血凝滴度。鞣化時採用的pH對吸附抗原和血凝滴度影響不大，一般採用pH7.2的PBS液。
紅血球的致敏
1．致敏抗原劑量的確定一般而言，在一定的範圍內，抗原的濃度與試驗的敏感性呈正比，超過這個範圍，再增加抗原，敏感性不會再提高，而且過大，有時會引起非特異性凝集。當採用一種新的抗原時，必須經過試驗，選擇適當的抗原致敏濃度，即把抗原稀釋成幾個不同的濃度分别致敏紅血球。再用這些致敏紅血球分別與標準陽性血清進行試驗，與標準陽性血清呈最高滴度的陽性反應的最小抗原劑量，即為該抗原的單位計量。致敏時，根據不同的抗原，可採用2～4個單位計量進行致敏。
2．致敏方法各種抗原的致敏方法大致相同，一般蛋白質的致敏方法如下：
所需濃度的抗原1份
pH6.4PBS液4份
2.50%的鞣化紅血球懸液1份
混勻，置37℃水浴30min，離心，沉澱後，以2.5%兔血清生理鹽水洗滌1次，懸浮於1份兔血清生理鹽水中。
3．影響紅血球致敏的因素
⑴要有高純度或高效價的抗原或抗體。
⑵被致敏抗原或抗體的適當劑量和濃度。如抗體一般以μg/ml IgG為宜。抗豬瘟IgG一般用80μg/ml～160μg/ml，抗口蹄疫IgG 20μg/ml~40μg/ml，抗豬水泡病IgG 130μg/ml~160μg/ml，抗豬肺疫IgG 30μg/ml ~40μg/ml，抗豬弓形體20μg/ml~40μg/ml，抗原一般用0.2mg/ml～1mg/ml。
⑶pH：除雞卵蛋白採用4.6～5.1外，其它通常採用5.6～6.4，高於7.2或低於4.6均可使紅血球發生自凝。
⑷致敏溫度：一般為37℃，範圍是20℃～40℃。
⑸致敏時間：一般採用30min為最適時間，具有良好的特異性和重複性。也有採用60min。時間過長，會造成紅血球的形態不整，反應結果紊亂等。
⑹血球濃度：一般為1%，範圍為0.5%～1.5%。
操作方法
可採用試管法、凹窩板法和微量法。前者稀釋度準確、結果清晰、終點明確。後者具有節約材料、操作方便、結果出現迅速等優點。
試管法的供試材料用兔血清鹽水二倍遞減稀釋，每管0.50ml，各管加致敏血球0.05ml，充分振盪，混勻後置室溫，紅血球完全沉下（需數小時）或過夜後判定結果。
每次試驗需做下列對照：①血清對照：最高濃度的血清+鞣酸血球；②鞣酸血球對照：兔血清鹽水+鞣酸血球；③致敏血球對照：兔血清鹽水+致敏血球；④標準陽性血清對照：稀釋已知滴度的陽性血清，加致敏血球以檢驗試驗的敏感性是否前後一致。
結果判定
++++：管底呈細密的顆粒凝集，邊緣不整齊。
+++：全管底呈光滑的均勻片層，邊緣摺疊。
++：全管底呈光滑的均勻片層，如傘狀。
+：管底大部分復以光滑片層，邊緣稍厚。
±：較“+”面積更小，中央有沉積的紅血球。
—：紅血球沉積在管底中央，如小圓盤或鈕扣狀。
以“++”為滴度終點。
