放線菌的鑑別方法
形態特徵
將活性菌株接種於高氏一號合成培養基,採用平皿插片法,28℃培養,用顯微鏡觀察各菌株的形態特徵。
培養特徵
採用平板劃線法將各活性菌株分別接種於燕麥汁培養基、高氏一號合成培養基等种放線菌形態特徵鑑定培養基上,28℃倒置培養,觀察菌株的基內菌絲、氣生菌絲的形態特徵、生長狀況及是否產生可溶性色素等特徵。
生理生化特徵
(1)生長pH範圍
配置JCM液體培養基(海水),設定pH值梯度為3、4、5、6、7、8、9、10、11、12,接種後28℃倒置培養,測定菌株生長的值範圍及最適生長值。
(2)生長溫度範圍
配置JCM液體培養基(海水),接種後置於4℃、14℃、20℃、28℃、37℃、45℃、50℃的培養箱中倒置培養,測定菌株生長的溫度範圍及最適生長溫度。
(3)耐鹽性
配置JCM培養基平板,NaCl濃度分別為0%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%,接種後28℃倒置培養14d,測定菌株生長的鹽度範圍及最適生長鹽度。
(4)碳源利用實驗
基礎培養基按照普戈二氏推薦的無碳源基礎培養基,不同碳源按照不同的濃度加入基礎培養基,以基礎培養基作為陰性對照(不加任何碳源)。分別在7d、14d、21d時觀察菌株的生長情況,生長優於對照的記錄為陽性,生長不如對照或差別不明顯則為陰性。
(5)酶學特徵實驗
明膠液化
將活性菌株接種於明膠培養基表面,28℃下培養,分別在7d、14d、21d、28d後觀察菌株生長狀況及培養基中明膠液化程度。觀察前將試管冷卻再觀察其液化情況。
牛奶凝固腖化
將活性放線菌菌株接種至牛奶凝固腖化培養基,28℃培養,分別在7d、14d、21d、28d時觀察培養基變化,若培養基中有凝塊產生則為牛奶凝固,若凝固後又有液體出現,即凝塊被進一步水解成液體,則為腖化現象,此時期稱為腖化期。以未接種的牛奶培養基作為空白對照。
澱粉水解
採用點接法將活性菌株接種到澱粉瓊脂平板上,28℃培養7-10d,在菌落的周圍滴加少量的盧哥氏碘液,若菌株能夠產生澱粉酶,會將澱粉水解成糊精或將澱粉利用掉,加入盧哥氏碘液後,觀察菌落周圍會出現不變色的透明圈,而透明圈的大小表示澱粉酶活性的強弱;若不產生澱粉酶,則菌落周圍遇到碘液呈藍色。
纖維素分解
滅菌前將纖維素培養基分裝於試管中,然後將濾紙條的一端浸在液體培養基中,另一端露在培養液外。滅菌後,將菌株點接於濾紙上,但不要碰到液體培養基,28℃靜置培養,30d後觀察濾紙條是否被分解。
銷酸鹽還原
將活性菌株接種到液體硝酸鹽還原培養基中,28℃震盪培養1-2周后測定,取少量培養液分別加入格里斯氏試劑A和B,溶液若變為粉紅色、玫瑰紅色、澄色、棕色等,表示有亞硝酸鹽存在,為摘酸鹽還原陽性。若不顯紅色,加入1-2滴二苯胺試劑,若顯藍色,則還原作用為陰性,若不呈藍色,仍按陽性對待。
(6)代謝產物實驗
硫化氯產生實驗
將菌株接種在H2S產生培養基上,28℃培養7-14d後觀察,如產生黑色素,則說明有硫化氫產生,H2S與檸檬酸鐵結合產生FeS,培養基呈現黑色。以未接種的培養基作為對照。
黑色素產生
將活性菌株接種到黑色素產生培養基上,28℃培養1-4周,觀察菌落邊緣是否有黑色素生成。
抗生素敏感性實驗
採用藥敏紙片法測定菌株對抗生素的敏感性。將菌液均勻地塗布在JCM平板(海水)上,同時以無菌鑷子取藥敏試紙片貼到培養基表面,28℃培養7d後觀察抑菌圈。選用種抗生素:紅黴素、氯黴素、利福平、、四環素、慶大黴素、新生黴素、卡那黴素、新黴素。