胺基酸活化與轉運

在蛋白質生物合成中,各種胺基酸在參入肽鏈之前必須先經活化,然後再由其特異的tRNA攜帶至核糖體上,才能以mRNA為模板縮合成肽鏈。胺基酸活化後與相應的tRNA結合的反應,均是由特異的氨基醯-tRNA合成酶(amino acyl-tRNA synthetase,簡寫為aaRS)催化完成的。

概述

在蛋白質生物合成中,各種胺基酸在參入肽鏈之前必須先經活化,然後再由其特異的tRNA攜帶至核糖體上,才能以mRNA為模板縮合成肽鏈。胺基酸活化後與相應的tRNA結合的反應,均是由特異的氨基醯-tRNA合成(aminoacyl-tRNAsynthetase,簡寫為aaRS)催化完成的。

活化反應

胺基酸-AMP-aaRS複合物的形成在aaRS、ATP及二價陽離子(如Mg2+)存在下,形成上述複合物並釋放出PPi。例如,丙氨酸-AMP-丙氨醯-tRNA合成酶(AlaRS)複合物的形成如下:氨基醯-tRNA的形成胺基酸以胺基酸-AMP-aaRS複合物的形式轉到tRNAAla上,形成Ala-tRNAAla。各種tRNA的3’端都有同樣的三個核苷酸的序列(-CCA)。胺基酸即結合在tRNA的3’-CCA末端腺苷酸(A)的核糖2’或3’游離-OH上,以酯鍵相連。上述胺基酸的活化反應,表示絕大多數胺基酸的活化過程。到目前為止,另發現有二種胺基酸(GLN和Ile)的活化有其特殊條件。Gln-tRNA複合物的形成如下,即先由一個Glu經GluRS作用接在tRNAGln上,形成Glu-tRNA;然後再經轉氨基酶作用,將Glu(或Asn)的醯胺基接到Glu-tRNA複合物的Glu上,最終形成Gln-tRNA複合物。

此外哺乳動物Ile-tRNA複合物的形成,在標準的tRNA氨基醯化反應系統中(50mmol/LTris-HClpH7.5,50mmol/LK+,2mmol/LMg2+,1mmol/LDTT,2mmol/LATP,aaRS,tRNA和標記的某種胺基酸),必須加入1-2mmol/L的多胺(如精胺),否則哺乳動物的tRNAIle不能被氨基醯化。

tRNA合成酶(aaRS)

aaRS存在於所有的生物體,定位於細胞漿。已從許多生物組織中提純,其分子量從2.27×104-2.7×105不等,有的由單一肽鏈組成,有的由幾個亞基組成,通常稱為α和/或β亞基。單個肽鏈的大小差別較大,從嗜熱桿菌(Bacillusstearothermophilus)的TrpRS含327個胺基酸殘基到E.coliIleRS含939個胺基酸殘基不等。來源於不同生物的同種aaRS其序列保守性亦不同,如酵母和細菌的同種aaRS比較,其同源性約在20%─50%範圍。

aaRS的活性中心一般含有一個或幾個-SH基,對該巰基進行化學修飾通常會導致酶失活,從而認為這些巰基在催化中發揮作用。例如,aa-AMP能夠與巰基反應形成巰酯鍵,然後再與tRNA反應。E.coliGlyRS由α2β2四個亞基構成,當用N-甲基縮蘋果醯胺(N-methy1-maleimide)去處理酶的-SH基,會導致GlyRS失活。已證明N-甲基縮蘋果醯胺滅活該酶的靶位置是β亞基的Cys395,以致阻止了aa-AMP與tRNA反應,但不抑制Gly-AMP複合物的形成。然而,並不是所有的半胱氨酸對酶的活性都有關鍵性作用。如GlyRS的β鏈含Cys98,Cys395和Cys450三個半胱氨酸,將這些Cys用Ala取代而形成的突變子,在體內、外均有活性。因為Ala取代幾乎不影響活性。人們認為N-甲基縮蘋果醯胺的作用基礎最可能是空間障礙所致。支持這一論點的證據是:Csy395→Gln395突變後,GlyRS的催化活性可下降10倍。

aaRS的兩個活性(形成aa-AMP複合物和aa-tRNA複合物)在肽鏈內具有較明確的結構域。aaRS的N端序列具有使aa-AMP複合物形成的活性,稱為aaRS的aa-AMP合成結構域,毗鄰aa-AMP合成結構域C端的部分序列具有識別特異tRNA的活性,稱為aaRS的aa-tRNA合成結構域。例如,E.coliAlaRS含四個α亞基,每條肽鏈含875個胺基酸殘基。分析表明,第1-461位胺基酸殘基組成的肽段具有使tRNAAla氨基醯化作用。其中,第1-368位殘基序列屬aa-AMP合成結構域,第369-461位殘基序列是結合tRNAAla的關鍵部位。第699-808位胺基酸殘基段對形成AlaRS四聚體(α4)是重要的。亦有一些研究顯示,aaRS結合tRNA的部位跨越在不同亞基間。據上述,aaRS具有高度的特異性,它至少有兩識別位點,既能識別特異的胺基酸,又能識別攜帶該種胺基酸的特異tRNA分子。在體內,每種aaRS都能從20種胺基酸中精確選擇與其相對應的一種,並識別出與此胺基酸相適應的特異tRNA,即一種胺基酸可被數種不同的同工tRNA攜帶。換言之,aaRS對胺基酸有嚴格的特異性,而對與此胺基酸相適應的數種同工tRNA則無嚴格的特異性

人們之所以對aaRS做了大量研究,主要是對其識別作用具濃厚的興趣。aaRS與相應的tRNA結合併不強,在生理pH,解離常數在0.1-1.0mmol/L範圍。當pH在5-5.5時,氨基醯化反應變慢,但結合力變強,解離常數為1-10nmol/L。相對弱的aaRS-tRNA反應需要的,因為酶在氨基醯化反應需迅速轉變,不能長時間與aa-tRNA形成複合物。1982年,已得到了AspRS-tRNAAsp複合物結晶,這些關鍵區域是胺基酸接受臂,二氫尿嘧啶莖,反密碼子莖和反密碼子。其後有一些實驗肯定了上述結果基本適合於其它aaRS-tRNA的相互結合部位。aaRS對tRNA的識別過程分二步進行:首先是酶與tRNA的初步結合,然後是tRNA的氨基醯化。tRNA分子上的反密碼子對於酶的識別作用是需要的,反密碼子是aaRS識別的主要特徵。然而,反密碼子並不是aaRS識別必需特徵。例如,Leu和Ser各有6個密碼子,這些密碼子可以被帶有不同反密碼子的同工tRNA閱讀。每一種同工tRNALeu或tRNASer僅由一種aaRS所特異地氨基醯化。這說明,反密碼子並非是aaRS識別的首要靶子,至少在這些酶是這樣。

aa-tRNA複合物的形成是非常精確的。aaRS在非常類似的胺基酸之間怎樣進行選擇,過去長時間迷惑不解。後來當發現IleRS如何精確區別Ile和Val後,特別令人鼓舞。Ile和Val僅有單個甲基之差,以致這二種胺基酸與IleRS的結合能之差僅2-3Kcal,這樣小的能差並不能阻止發生錯誤的結合,即阻止IleRS去識別Val。例如,當等克分子的Ile和Val混合併加入IleRS後,可產生10-2的錯誤頻率。但活化的Val與tRNAIle結合率非常低。當tRNA與Val-AMP-IleRS結合成複合物時,幾乎所有的Val-AMP分解為Val和AMP。這樣,在Ile和Val之間的鑑別能夠發生二次,最終的錯誤頻率為10-2×10-2=10-4。現在進一步清楚單通過這些酶的校正是不足以達到足夠精確度。近年來,通過對TyrRS三維結構的研究獲得了對aaRS識別作用的新認識。已證明TyrRS在二個非常類似的胺基酸Phe和Tyr二者之間進行選擇是通過與Tyr的-OH基形成特殊的氫鍵,而不僅僅是通過前述的校正方式。據目前所知,以特殊氫鍵而區別的胺基酸還有Asp,Asn,Cys,His,Lys和Trp。一旦一個特殊的胺基酸被連線到tRNA分子上,在蛋白質合成的後續步驟中便沒有任何特異的識別和校正方式。如當Cys-tRNACys形成後,再修飾為Ala-tRNACys,把後者加入血紅蛋白無細胞合成系統,新合成的Hb肽鏈中的Cys位便均被Ala占居。因此,tRNA是唯一能選擇模板的分子。

近年來(1983-1986年)的免疫學研究顯示,某些心肌炎病人具有直接針對HisRS,ThrRS和AlaRS的自身抗體。在具有AlaRS自身抗體的病人,也有抗tRNAAla抗體。由此提出了這樣的可能性:抗tRNAAla抗體是直接針對AlaRS抗體的獨特型抗體,而抗AlaRS抗體直接針對AlaRS的tRNAAla結合位點,提示tRNAAla結合部位是具有抗原性的。通過X射線結晶學證明酶和aa-AMP之間可能有11個氫鍵,酶的側鏈和主鏈(MC)均涉及到反應。它們的相互作用除氫鍵外,還有VanderWaal力。如果用Phe取代Tyr,則不能形成VanderWaal力相互作用。

相關詞條

相關搜尋

熱門詞條

聯絡我們