簡介
提取培養細胞
一, (動物實驗室)先用酒精沖洗灌流系統,然後用蒸餾水再次沖洗(流速可稍快)
二,(細胞實驗室)製作凝膠培養皿(為了有助於細胞貼壁),0.1%gelation 移液器 2ml/皿,輕輕搖晃,讓relation充分鋪在培養皿底部,然後放入37℃,5%CO2的恆溫箱中1小時.
1.細胞操作台是無菌區域,操作前要用酒精洗手,需要放入操作台里的藥劑也要用酒精消毒,尤其是瓶口.
2.添加gelation順序為移液器吸取2mlgelation→打開培養皿蓋子→注入gelation→蓋上蓋子→輕搖
三,製作肝臟沖洗液和肝細胞分離液
抽取SolutionⅠ40ml加入刻度試管中(兩個 40ml/試管)
抽取SolutionⅡ30ml加入刻度試管中(兩個 30ml/試管);抽取SolutionⅡ70ml加入刻度試管中(兩個 70ml/試管)
將SolutionⅡ30ml的兩個試管加入恆溫箱中預熱
分別稱量12mg和5.4mg各兩份collagenase ,稱量蛋白酶12mg(使用敏感度高的測量器)
四,取小鼠,麻醉0.3ml苯巴比妥/只,觀察小鼠呼吸轉為淺快說明麻醉成功.剪取兩條長約250px絲線,置於淨水中備用
將SolutionⅠ40ml溶液與灌流器相連,用剪刀剪開小鼠腹部毛皮,然後用手充分撕開毛皮,儘量暴露胸腹部,用剪刀剪開小鼠腹部肌肉,露出肝臟和肝靜脈,將之前備好的細線給小鼠肝靜脈打一個鬆散的活結備用,打開灌流器,將流量調低,用針管穿刺肝靜脈並固定,順手剪開小鼠股動脈(右側),觀察肝臟有限紅色逐漸變白然後呈淺黃色,且股動脈有液體流出,說明穿刺成功,調高灌流速度, SolutionⅠ40ml溶液灌流結束後,灌流SolutionⅡ70ml+12mgcollagenase溶液.
1.灌注SolutionⅡ70ml+12mgcollagenase是為了細胞間質的膠原蛋白,讓肝細胞鬆散,易於提取.灌注速度3-4ml/min
2.灌注SolutionⅡ70ml+12mgcollagenase成功後,小鼠肝臟會呈現類似與乳糜狀,用鑷子輕觸即破.
3.隨著灌流液量增加,小鼠麻醉藥也隨之排除體外,此時小鼠會出現甦醒並抽搐.
五,灌流結束後,用剪刀摘取小鼠肝臟,放置於培養皿中(SolutionⅡ12mgcollagenase),在顯微鏡下去除膽囊和大血管,用鑷子輕輕剝離肝細胞,並用剪刀將未完全分離的肝組織剪碎.
5.4mgcollagenase+蛋白酶12mg+DNA酶0.06ml加入30ml SolutionⅡ溶液中混勻做成勻液,將剝離的肝細胞和組織倒入勻液中,置於37℃恆溫液箱中輕微振盪消化處理30min.(加入DAN酶是因為DNA有粘著性，防止細胞聚集粘著)。
六，消化處理後的勻液中加入培養液終止消化反應，20g 5min離心分離（肝細胞較重離心後沉於試管底部，上清液大多是細胞外雜質），離心後去除上清液，然後用PBS（PH和滲透壓與細胞大致相同）沖洗1-2次，在培養液中加入雙抗，然後顯微鏡下細胞計數。
細胞計數的計數板上的四個正方形角落有很小的計數方格，細胞計數時分別計數那4個小方格，算出平均值X。細胞數=X*10/ml，每個培養皿中要加入5*10個細胞+1.5ml細胞培養液，顯微鏡下觀察細胞懸浮於培養基中，然後放入37℃,5%CO2的恆溫箱中培養。
七，LPS通常置於有菌的環境中，因此進行細胞培養前要先過濾。1000微克的LPS溶於10mlDMEM，過濾，然後加入30ml DMEM充分混勻。
攻擊細胞
1.在培養皿上分類表明時間；2.去除上清液；3.PBS沖洗 2ml/皿 2次；4.前兩組為對照組加普通培養液；5.往後每組加2.5ml LPS混合液；6. 放入37℃,5%CO2的恆溫箱中反應。
取細胞
1.按時間分類，抽取上清液；2. PBS沖洗 2ml/皿 2次；3. Lysis buffer （破壞細胞）100ml/皿；4.cell刷酒精消毒→蒸餾水清洗→吸水紙吸乾蒸餾水→刷取細胞；5.微量移液器移出樣本；6.回收細胞表明時間，密封，保存於-80℃冰櫃中。
