基本概述
細胞培養設施器材
無菌室器材：
一、玻璃器材培養皿、滴流瓶、刻讀吸管、離心管、培養瓶、燒杯、量筒、三角燒瓶
二、塑膠器材
多孔培養板、培養皿、培養瓶
三、橡皮器材
橡皮製品（最好是矽製品）做各種瓶或試管的塞子、蓋子。
四、金屬器材
剪刀、鑷子、手術刀、解剖刀、血管鉗、組織鑷、眼科鑷及各種型號針頭
五、其他物品
紗布、注射器和針頭
培養基
幾種常用細胞培養基產品⒈BME（basalmediumeagle）基礎伊格培養基
⒉MEM
⒊DMEM
⒋IMDM
⒌RPMI-1640
⒍M199
⒎Mccoy's5A
⒏F10\F12\DMEM混合F12（三）幾種常用細胞培養配套試劑的配置（緩衝液、平衡鹽溶液等）
1、無鈣、鎂、離子溶液（1000ml)
氯化鈉（NaCl)8g磷酸二氫鈉、（NaH2PO4H20）0.05g、氯化鉀（KCl)0.2g、碳酸氫鈉（NaHCO3）1g、檸檬酸三鈉(Na3C6H5O7,H20）1g、葡萄糖1g、加去離子水或雙蒸水至1000mL
2、PBS（Phosphate-Bufferedsaline）磷酸鹽緩衝液
甲液：0.2mol/L磷酸氫二鈉溶液、磷酸氫二鈉（無水）28.4g、氯化鈉8.77g加去離子水或雙蒸水至1000mL
乙液：0.2mol/L磷酸二氫鈉溶液、磷酸二氫鈉（無水）2.4g、氯化鈉8.77g加去離子水或雙蒸水至1000mL
甲、乙液於4℃保存，使用時按表3-2所示比例，配製成所需pH濃度，高壓滅菌後室溫保存。
3、Hanks液（HBSSHank‘sBalancedsaltsolution)
⑴母液甲（20x）配法
①NaCl(A.R)160g、KCl(A.R)8g、MgSO4.7H2O（A.R)2g、MgCl.6H2O(A.R)2g依次溶於800mL雙蒸水中，前一物質溶後再加後一種。
②CaCl2(A.R)2.8g溶於100mL雙蒸水中，溶時不斷攪拌（此液應單配，單溶）。
待上述兩溶液中的“溶質”全溶後，將它們混合，再用雙蒸水補至1000mL，向其中加2mL氯仿作為防腐劑，置4℃保存。
⑵母液乙（20×）配法
①Na2HPO4.12H2O(A.R)3.04g、KH2PO4(A.R)1.20g、葡萄糖（A.R)20.0g溶於800ml雙蒸水中。
②0.4%酚紅液0.4g酚紅放在玻璃研缽後加0.01N、NaOH11.28mL，直到全部溶解，移入100mL容量瓶中，加水至100mL，過濾，pH為7.4，4℃保存。
待上述各“溶質”完全溶解後，用雙蒸水補至1000mL,其中加氯仿2mL作防腐劑，置40℃保存。
3）使用液（1×）配法
取母液甲和母液乙各一份，加雙蒸水18份，分裝後，塞好瓶塞，掛上標誌。以115℃高壓滅菌25分鐘（以免葡萄糖破壞），置室溫後4℃保存，可使用幾個月。臨用前，用7.5%NaHCO3調至所需pH。
4、Eagle's液（EBSSEagle'sBalancedsaltsolution)
是一種在二氧化碳（CO2）環境中短期維持細胞活性的平衡鹽溶液，可用於細胞解離前的清洗、細胞或組織的運輸、細胞計數時稀釋、溶液的配置等。
5、HEPES液
生物緩衝液，化學性質穩定，在PH7.2——7.6範圍內，比NaHCO3緩衝液的緩衝能力更強。
6、NaHCO3緩衝液
常規緩衝體系的一部分，但是不穩定，易受空氣中CO2的含量而改變PH值，影響緩衝效果。
具體步驟
一、復甦1.把凍存管從液氮中取出來，立即投入37℃水浴鍋中，輕微搖動。液體都融化後(大概1-1.5分鐘)，拿出來噴點酒精放到超淨工作檯里。
2.把上述細胞懸液吸到裝10ml培養基的15ml的離心管中(用培養基把凍存管洗一遍，把粘在壁上的細胞都洗下來)，1000轉離心5分鐘。
3.把上清液倒掉，加1ml培養基把細胞懸浮起來。吸到裝有10ml培養基的10cm培養皿中前後左右輕輕搖動，使培養皿中的細胞均勻分布。
4.標好細胞種類和日期、培養人名字等，放到CO2培養箱中培養，細胞貼壁後換培養基。
5.3天換一次培養基。
二、傳代
1.培養皿中的細胞覆蓋率達到80%-90%時要傳代。
2.把原有培養基吸掉。
3.加適當的胰蛋白酶(能覆蓋細胞就行)，消化1-2分鐘。
4.細胞都變圓後加如入等體積的含血清的培養基終止消化。
5.用移液槍吹打細胞，把細胞都懸浮起來。
6.把細胞吸到15ml的離心管中，1000轉離心5分鐘。
7.倒掉上清液，加1-2ml培養基，把細胞都吹起來。
8.根據細胞種類把細胞傳到幾個培養皿中。一般，癌細胞分5個，正常細胞傳3個。繼續培養。
三、凍存
把細胞消化下來並離心(同上)。用配好的凍存液把細胞懸浮起來，分裝到滅菌的凍存管中，靜止幾分鐘，寫明細胞種類，凍存日期。4℃30min，-20℃30min，-80℃過夜，然後放到液氮灌中保存。
凍存液的配製：70%的完全培養基+20%FBS+10%DMSO.DMSO要慢慢滴加，邊滴邊搖。
一般過程
一、準備工作準備工作對開展細胞培養異常重要，工作量也較大，應給予足夠的重視，準備工作中某一環節的疏忽可導致實驗失敗或無法進行。準備工作的內容包括器皿的清洗、乾燥與消毒，培養基與其他試劑的配製、分裝及滅菌，無菌室或超淨台的清潔與消毒，培養箱及其他儀器的檢查與調試，具體內容可參閱有關文獻。
二、取材
在無菌環境下從機體取出某種組織細胞（視實驗目的而定），經過一定的處理（如消化分散細胞、分離等）後接入培養器皿中，這一過程稱為取材。如是細胞株的擴大培養則無取材這一過程。機體取出的組織細胞的首次培養稱為原代培養。理論上講各種動物和人體內的所有組織都可以用於培養，實際上幼體組織（尤其是胚胎組織）比成年個體的組織容易培養，分化程度低的組織比分化高的容易培養，腫瘤組織比正常組織容易培養。取材後應立即處理，儘快培養，因故不能馬上培養時，可將組織塊切成黃豆般大的小塊，置4℃的培養液中保存。取組織時應嚴格保持無菌，同時也要避免接觸其他的有害物質。取病理組織和皮膚及消化道上皮細胞時容易帶菌，為減少污染可用抗菌素處理。由組織並分離分散細胞的方法可參閱有關文獻。
三、培養
將取得的組織細胞接入培養瓶或培養板中的過程稱為培養。如系組織塊培養，則直接將組織塊接入培養器皿底部，幾個小時後組織塊可貼牢在底部，再加入培養基。如系細胞培養，一般應在接入培養器皿之前進行細胞計數，按要求以一定的量（以每毫升細胞數表示）接入培養器皿並直接加入培養基。細胞進入培養器皿後，立即放入培養箱中，使細胞儘早進入生長狀態。正在培養中的細胞應每隔一定時間觀察一次，觀察的內容包括細胞是否生長良好，形態是否正常，有無污染，培養基的PH是否太酸或太鹼（由酚紅指示劑指示），此外對培養溫度和CO2濃度也要定時檢查。一般原代培養進入培養後有一段潛伏期（數小時到數十天不等），在潛伏期細胞一般不分裂，但可貼壁和遊走。過了潛伏期後細胞進入旺盛的分裂生長期。細胞長滿瓶底後要進行傳代培養，將一瓶中的細胞消化懸浮後分至兩到三瓶繼續培養。每傳代一次稱為“一代”。二倍體細胞一般只能傳幾十代，而轉化細胞系或細胞株則可無限地傳代下去。轉化細胞可能具有惡性性質，也可能僅有不死性（Immortality）而無惡性。培養正在生長中的細胞是進行各種生物醫學實驗的良好材料。
四、凍存及復甦
為了保存細胞，特別是不易獲得的突變型細胞或細胞株，要將細胞凍存。凍存的溫度一般用液氮的溫度——196℃，將細胞收集至凍存管中加入含保護劑（一般為二甲亞碸或甘油）的培養基，以一定的冷卻速度凍存，最終保存於液氮中。在極低的溫度下，細胞保存的時間幾乎是無限的。復甦一般採用快融方法，即從液氮中取出凍存管後，立即放入37℃水中，使之在一分鐘內迅速融解。然後將細胞轉入培養器皿中進行培養。凍存過程中保護劑的選用、細胞密度、降溫速度及復甦時溫度、融化速度等都對細胞活力有影響。
一般條件
簡言之，即細胞需要什麼就提供什麼，道理是如此，真正能做到這點尚需時日，人們至今對細胞的生命周期控制機理認識不足，癌細胞雖然也來自正常細胞，但至今不知道究竟為什麼癌細胞很難停止已經啟動的有害分裂，儘管如此，人們長期的研究結果表明，離體細胞培養需要的基本條件就是下列細胞生理條件。⑴溫度
恆溫培養箱⑵pH
過酸或過鹼可導致細胞死亡。這主要與蛋白質的變性和細胞膜的結構受損有關。⑶滲透壓
細胞內外可溶於水的物質比例和種類決定細胞的膨脹與收縮程度，因為細胞膜是半透膜，只允許對自己有利的物質通過。同一物質在細胞內外的分布的數量不同，當某一種極溶於水的物質在細胞外濃度過大時，有可能導致細胞乾癟死亡，這些物質在細胞內過多時導致細胞過量吸水膨脹。細胞膜調節滲透壓的能力是有限的。⑷營養物
營養物和水一起，又叫細胞培養液，培養液中含有細胞增殖和生長所需要的各種物質。營養物包括：N源、C源，這些物質與提供能量有關；無機鹽、維生素、激素，這些物質與代謝調節控制有關。細胞培養液的設計一直是細胞離體培養技術的關鍵。理想的細胞培養液可以同時解決細胞離體培養所需要的pH、滲透壓、營養物、調節物質的全部需要。在幹細胞分化研究與套用中，關鍵是找到一種使幹細胞分化成為所需細胞和組織的營養液。相同的人幹細胞，放在不同的營養液中分化培養出人的各種臟器，這個昔日的夢想已經開始成為現實。植物細胞的組織培養技術已經基本完善配套。名貴花卉、中草藥、脫毒馬鈴薯、組織培養蓮菜苗等植物細胞與組織培養技術的不斷完善，特別是由於組織培養液的商品化已經被廣大農民普遍接受。⑸水
水是細胞需要數量最大的物質，不同的物種、不同部位、不同生長期的細胞含水量差別相當大。乾旱植物細胞的含水量高達90%。水的需求量一般隨同細胞培養液一起考慮。⑹無菌條件
體外細胞培養僅僅是對所需的細胞進行培養，但環境中（如空氣）有各種其他微生物，必須對所需細胞進行無雜菌的隔離培養。無菌條件是細胞離體培養最基本的條件。⑺光
植物細胞和少數細菌需要利用光進行光合作用。⑻氣體
動物細胞需要不斷供給氧氣和排除二氧化碳，植物細胞與此相反。二氧化碳的作用：調節pH，有緩衝作用，沒有刺激動物細胞呼吸的功能
培養條件
動物細胞培養
高速冷凍離心機⑴血清：動物細胞離體培養常常需要血清。最常用的是小牛血清。血清提供生長必需因子，如激素、微量元素、礦物質和脂肪。有一天人們真正學會了配製和血清一樣的培養液，那時血清才可被取代。在這裡，血清等於是動物細胞離體培養的天然營養液。
⑵支持物：大多數動物細胞有貼壁生長的習慣。離體培養常用玻璃，塑膠等作為支持物。
⑶氣體交換：二氧化碳和氧氣的比例要在細胞培養過程中不斷進行調節，不斷維持所需要的氣體條件，每一次開箱操作後的快速恢復對設備的要求可想而知有多難？由此決定了動物細胞離體培養設備要求高、投資大。
植物細胞培養
⑴光照：離體培養的植物細胞對光照條件不甚嚴格，因為細胞生長所需要的物質主要是靠培養基供給的。但光照不但與光合作用有關，而且與細胞分化有關，例如光周期可對性細胞分化和開花調控作用，所以以獲得植株為目的的早期植物細胞培養過程中，光照條件特別重要。以植物細胞離體培養方式獲得重要物質，如藥物的過程，植物細胞大多是在反應器中懸浮培養。⑵激素：植物細胞的分裂和生長特別需要植物激素的調節，促進生長的生長素和促進細胞分裂的分裂素是最基本的激素。植物細胞的分裂，生長，分化和個體生長周期都有相應的激素參與調節。和動物細胞相比，植物細胞離體培養對激素要求的原理已經了解，其套用技術也已相當成熟，已經有一套廣泛作為商品使用的培養液。同時解決了植物細胞對水、營養物、激素、滲透壓、酸鹼度、微量元素等的需求。
微生物細胞培養
微生物多為單細胞生物，野生生存條件比較簡單。所以微生物人工培養的條件比動植物細胞簡單得多。其中厭氧微生物培養比好氧微生物複雜，因為嚴格厭氧需要維持二氧化碳等非氧的惰性氣體濃度，而好氧微生物則只需要通過不斷攪拌提供無菌氧氣。微生物對培養條件要求不如動植物細胞那樣苛刻，玉米漿、蛋白腖、麥芽汁、酵母膏等成為良好的微生物天然培養基。對於一些特殊微生物的營養條件要求，可以在這些天然培養基的基礎上額外添加。注意事項
1、實驗進行前，無菌室及無菌操作台（laminarflow）以紫外燈照射30-60分鐘滅菌，以70%乙醇擦拭無菌操作抬面，並開啟無菌操作颱風扇運轉10分鐘後，才開始實驗操作。每次操作只處理一株細胞株，且即使培養基相同亦不共享培養基，以避免失誤混淆或細胞間污染。實驗完畢後，將實驗物品帶出工作檯，以70%ethanol擦拭無菌操作台面。操作間隔應讓無菌操作台運轉10分鐘以上後，再進行下一個細胞株的操作。2、無菌操作工作區域應保持清潔及寬敞，必要物品，例如試管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暫時放置，其它實驗用品用完即應移出，以利於氣流之流通。實驗用品以70%ethanol擦拭後才帶入無菌操作台內。實驗操作應在抬面之中央無菌區域，勿在邊緣之非無菌區域操作。
3、小心取用無菌之實驗物品，避免造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或是容器瓶口，亦不要在打開的容器正上方操作實驗。容器打開後，以手夾住瓶蓋並握住瓶身，傾斜約45°角取用，儘量勿將瓶蓋蓋口朝上放置桌面。
細胞培養5、定期檢測下列項目：5.1CO2鋼瓶之CO2壓力5.2CO2培養箱之CO2濃度、溫度、及水盤是否有污染（水盤的水用無菌水，每周更換）。5.3.無菌操作台內之airflow壓力，定期更換紫外線燈管及HEPA過濾膜，預濾網（300小時/預濾網，3000小時/HEPA）。6.水槽可添加消毒劑(Zephrin1:750），定期更換水槽的水
6、粉末培養基配製好後（加了血清），一般在4度儘量不要超過1個月，如在-20度存放時間可長一些，但最好也不要超過3-4個月，可能對於永生化細胞株來說要求不是太高，細胞嬌弱，放置時間不宜過長。
7、開紫外線照射台的時候，就將培養基、酶、DHANKS液那到室外讓它自然升溫。這樣40分鐘後，溫度也升上來了。有很多人將其放到37度水浴鍋里加熱。一定要注意水浴鍋的衛生，有的常年不清洗，裡面很髒，容易在外面瓶身上吸附大量細菌。因此用時也一定要勤換水。從水浴鍋拿出後，最好找個毛巾擦乾上面的水。
意義
⒈可以進行植物體外受精及植物胚胎髮育過程研究。⒉可以進行植物生長發育有關的重要基因或影響因素的研究。
⒊可以方便地通過實驗手段培育植物新品種。
方式
群體培養
澳大學教授左小臂“長”出耳朵克隆培養
挑選單個細胞或單一集落（克隆）於體外進行培養。常用於細胞克隆化（純化），建立細胞株，長期傳代。優點
1、能長期傳代，保持活性，便於監控檢測結構功能和生命活動。2、培養條件可以人為的控制便於研究細胞代謝、物理、化學、生物因素的影響
3、可用於各種觀察和檢測手段研究活細胞的變化（變異、分化）。可從細胞水平開展亞細胞結構和代謝分子的表達。
4、研究範圍和細胞來源廣泛，選擇性廣。
5、不同代次細胞可長期保存，既可開展同代次不同條件和方法研究，又可觀察不同代次的動態變化。
6、耗資少、經濟、成本低、可大量培養，利於生物製品的生產。
