簡介
眼鏡蛇毒素是由眼鏡蛇的毒腺分泌的一種天然毒蛋白，其化學成分非常複雜，含有多種蛋白質、多肽、酶類和其他小分子物質，具有廣泛的生物學活性，可作為天然的藥用資源，如溶血、抗腫瘤等。其中約75%~85%為蛋白質。蛋白質成分有100種以上，其中25%～40%左右為細胞毒素(Cytotoxin)，又稱為膜毒素(Membrane toxin)或心臟毒素(Cardiotoxin)，是眼鏡蛇毒的主要毒性成分之一，是一類既具有心臟毒性，又具有細胞毒性，尤其是對腫瘤細胞有毒性的組分，在蛇毒抗腫瘤作用的研究中占首要地位。
細胞毒素(cytotoxin，CTX)是眼鏡蛇毒中重要的一類活性蛋白，它們的胺基酸序列和空間結構相當保守，但生物學活性卻多種多樣，如引起可興奮性組織(骨骼肌、心肌及神經組織)去極化、溶解腫瘤細胞、心臟毒性和抗菌活性等。不同地區、不同蛇種的蛇毒中含有不同的CTX，且同種蛇毒中也含有2～5個CTX，它們的結構及生物學活性有一定差別，對它們的結構與功能的研究是生物毒素研究的熱點之一。
細胞毒素是蛇毒三指蛋白家族的一員，是眼鏡蛇毒的主要毒性成分之一，具有心臟毒、抑制骨吸收、引起可興奮組織去極化、抗菌等多種生物學活性，並可誘導多種腫瘤細胞凋亡。眼鏡蛇毒細胞毒素對癌細胞的抑制作用的確切機制尚不清楚，有些學者認為細胞毒破壞細胞的作用機制主要是依賴毒素分子有較多的鹼性基團與細胞膜表面磷脂的酸性基團結合，進而由毒素分子內高含量的疏水側鏈與脂層作用，從而擾亂雙層膜達到破壞細胞膜的作用。而有的學者卻不支持這一觀點，但不論其機制如何，對腫瘤細胞的殺傷作用是確實的，與眼鏡蛇毒粗毒比較，48h對鼻咽癌的半數抑制濃度為22mg・L-1，可提高約10倍左右。
物化性質
理化性質從蛇毒中分離純化得到不含PLA2的CTX是進一步研究其理化性質、準確測定其生物學活性等的先決條件。根據蛇毒和磷脂酶A2分子量大小，電荷，以及疏水性不同，可以將含CTX組分純化。許多學者都相繼從不同來源的蛇毒中分離提純出CTXs。對CTXs的分離多採用陽離子交換層析合併凝膠過濾的方法。
眼鏡蛇毒CTX是蛇毒的主要活性成分，約占粗毒的20%-40%，其化學本質為蛋白質，是強鹼性的小分子單肽，由15~17種胺基酸的60~62個殘基組成，相對分子質量為6000-7000，易溶於水，耐強酸、強鹼，對水解酶具有抗性作用，在室溫下極為穩定。等電點11~12，含有較多的賴氨酸和亮氨酸，有25個疏水胺基酸，其8個半胱氨酸交叉聯結成4對二硫鍵。
圖冊“細胞毒素質譜分析”參考資料。
CTX含大量疏水性殘基，占全部殘基的一半。二級結構主要由單一摺疊組成，缺乏α-螺鏇結構，通過X射線衍射和核磁共振方法分析其三維空間結構，呈三指形，4個二硫鍵聚集在一起形成一個緻密核心，從此球狀區域伸出的3個緊鄰的富含β摺疊的指( loop)，形成典型的“三指”結構。二級結構分析結果顯示它缺乏α－螺鏇結構，主要由β摺疊組成。在第三環和第二環之間的裂隙的大小與該細胞毒的毒性正相關，而二級結構中的三重和兩重的反平行β摺疊則是第三環移位的關鍵。細胞毒素對熱穩定．對水解酶有抗性，能引起可興奮性細胞如骨骼肌、心肌和神經組織去極化，可增加細胞膜通透性，阻滯軸突傳導，以及溶解腫瘤細胞等，而其主要作用點在細胞膜上。
三指(loopⅠ、loopⅡ、loopⅢ)指端為疏水性胺基酸，指側則帶有正電荷的精氨酸、賴氨酸。有學者認為CTX通過靜電力、疏水力與脂質生物膜結合，並通過loopⅡ和loopⅠ插入膜中，產生作用，CTXs在loopⅡ的頂端存在陽電荷，可能通過靜電吸引力在膜上定位，loopsⅠ和Ⅱ的指表面帶有較多的疏水胺基酸，插入細胞膜中形成孔洞，導致細胞溶解。在loopⅡ頂端有一個典型的Ω-樣結構，此結構使得loopsⅠ和Ⅱ插入膜的深度相同，並增加它們的作用範圍。ZaheerA比較了三種蛇毒多肽的結構及它們對正常細胞和癌細胞的功能，發現它們結合於膜上不同的受體，而這種選擇性是由它們所帶的電荷以蛋白質結構決定的，但不存在單一的功能區，多肽鏈上的許多位點都和其活性有關。
由於蛋白質結構分析技術的發展，從而對CTX的作用機制提出了新的看法。結構分析表明，CTX的三指狀結構有利於其與細胞膜結合，破壞膜結構而產生毒性作用。有人通過研究及計算機模擬技術，提出了CTX與細胞膜結合的模擬示意圖，認為CTX通過經典吸引力吸附在帶負電荷的膜上，然後通過三指頂端的疏水殘基插入膜中。當結合在膜上的CTX量達到臨界濃度會發生寡聚同時誘導膜脂質重新排列形成孔道，孔道的形成可能是CTX產生細胞毒性、導致細胞碎裂的主要原因。
1967年Braganca等採用Sephadex-G50凝膠過濾、CM-cellulose層析等對眼鏡蛇(Naja naja atra)粗毒進行洗脫，從洗脫的4個吸收峰中分離出CTXP6。杜雨蒼等採用SP-Sephadex C-25柱上平衡層析方法，從廣東產眼鏡蛇毒中純化出細胞膜毒素D1。Kaneda N等利用反相高效液相色譜一步法從眼鏡蛇毒中分離CTX。Ohkura K等以Sephadex-G75凝膠及CM-cellulose層析從泰國眼鏡蛇毒中分離獲得CTX。許雲祿等採用SP-Sephadex C-25陽離子交換法及Sephasil Peptide C18反相高效液相色譜法從舟山眼鏡蛇毒中純化出細胞毒素，並測定其N端20個胺基酸序列。Gomes等從印度眼鏡蛇(Ophiophagus hannah)中分離出一種獨特的細胞毒素CM55，其分子量為21.5～22.5kD，豚鼠實驗表明，CM55能導致豚鼠心電圖異常，其中包括使QSR波群變寬和室性心動過速。1993 年，Hung et al首先從台灣地區舟山眼鏡蛇毒中分離出CTXn，並確定了其一級結構，其胺基酸序列和其他細胞毒素相似度達到80-92%。其空間結構呈三指結構，由4對二硫鍵偶聯而成。其後Chen 等分別運用離子交換色譜和reverse-phase HPLC兩種分析方法證明台灣東部地區蛇毒含有CTXn（CTXA6），西部地區則不含該成分。
CTX具有多種生物活性，可引起心臟攣縮，停跳在收縮期，這是CTXs心臟毒性的典型表現。另外，CTXs可引起肌細胞膜不可逆去極化及細胞毒作用，對刺激神經間接產生的肌肉收縮及直接刺激肌肉產生的收縮均有阻斷作用，據此可與眼鏡蛇毒中另一主要成分-神經毒素相鑑別，後者僅阻斷刺激神經引起的收縮，對直接刺激肌肉引起的收縮無影響。CTX的常規鑑定方法即為離體心臟毒性實驗和離體膈神經-膈肌毒性實驗。
毒理學
有關CTX毒性的研究開展已久，半數致死劑量為2.4795mg/kg，但其作用機制尚未明了。CTXs作用後期常表現為溶細胞作用，細胞膜裂解成碎片（故又名膜毒素），因此關於CTXs的作用機制，多數學者長期以來把目光聚焦在細胞膜上。CTXs屬於三指毒素家族（three-fingertoxins），其4個高度保守的二硫鍵使得CTX的空間結構呈“三指”狀，三指指端為疏水性胺基酸，指側則帶有正電荷的精氨酸、賴氨酸，研究認為，這種兩性指狀結構有利於CTXs與細胞膜結合，CTXs發生寡聚同時誘導膜脂質重新排列形成孔道（poreformation），孔道的形成可能是CTXs產生細胞毒性、導致細胞碎裂的主要原因。在早期的研究中，Dimar等比較了大量蛇毒CTXs，提出細胞毒溶胞能力的大小與CTXs分子正負電荷多少成正比。Lauterwein等據此提出了CTXs與磷脂結合的模型，認為CTXs如同陽離子除垢劑，帶正電荷的陽離子頭端與磷脂雙層極性層的陰離子部位結合而定位，疏水性基團部分插入細胞中而使細胞膜破壞。ZaheerA等認為CTX是通過抑制細胞膜上Na+-K+-ATPase干擾膜轉運機制而起作用。CTXs的二硫鍵可能被轉移至Na+-K+-ATPase的疏水基上，使該酶失活，細胞內外Na+、K+比例失調，使葡萄糖等等物質不能偶聯轉運，從而導致細胞腫脹、破裂。另外，由於眼鏡蛇毒中另一主要成分―――神經毒素髮現能與乙醯膽鹼競爭膽鹼能受體，因此有學者推測CTXs也可能有膜受體蛋白。
許多學者報導了CTXs與膜磷脂7-11或糖脂12-13有親和力，阻斷或抑制這種結合，會減弱CTXs的細胞毒作用。事實上多個研究室將CTXs作為研究蛋白質―脂質相互作用的工具，探索生物膜的物理及生化特性； 一些學者則認為細胞膜上存在CTXs的受體蛋白質，Su，S. H.等發現CTXs可與外周血單核細胞的膜蛋白結合，並確定該膜蛋白的分子量分別為92，77和68kD，據此提出CTXs可能通過與膜蛋白結合，啟動相應的信號通路發揮作用。在對CTXs 的膜作用研究中，Chiou，S. H.等15-16報導CTXs抑制蛋白激酶C的活性，抑制程度與CTXs 的抗腫瘤作用相關。CTXs 結構的區別會反映到它們對PKC的抑制力上。Chia H.W.等的研究顯示，CTX作用於不同的細胞可引起胞內Ca2+([Ca2+]i)，並出現凋亡或壞死：神經元細胞以凋亡為主，心肌細胞和膠質細胞以壞死為主。以3-硫基-半乳糖脂的單克隆抗體抑制CTX的膜結合，可抑制CTX升高[Ca2+]i 的作用，同時細胞毒性作用降低。
CTXs能與線粒體特有的心磷脂結合，據此Wang，C. H.等（2005）以FITC標記CTX A3，在雷射共聚焦顯微鏡下觀察活的H9C2細胞，發現大部分CTX A3在15min內移入胞內定位於線粒體，顯示線粒體是CTX A3的胞內結合靶點之一；同時檢測到[Ca2+]i在數分鐘內升高，1h 後線粒體明顯水腫；以Ca2+鰲合劑去除胞內Ca2+後，對CTXs的線粒體定位無明顯影響，但線粒體水腫、崩解現象有所減弱。表明作用於線粒體與升高[Ca2+]i是CTX A3的兩條作用途徑，兩者對CTX-A3發揮細胞毒作用具有協同性。Arseniev AS等（2005）報導了CTXs對細胞內另一種膜結構―溶酶體的作用：以共聚焦色譜成像（confocal spectralimaging，CSI）技術觀察螢光標記的不同種蛇毒來源的CTXs對A549細胞及HL60細胞的作用，發現CTXs輕易進入A549細胞及HL60細胞中，濃集於溶酶體，且CTXs的溶酶體濃度與其細胞毒作用呈現密切的量效關係，由此提出CTXs對細胞膜的作用可能是胞內作用的下游事件。以上研究顯示，CTXs作為小分子多肽，在數分鐘內即進入細胞內，產生效應。
抗癌作用
基本情況20世紀50年代起即開始了套用蛇毒治療惡性腫瘤的研究，結果發現蛇毒可使一些腫瘤生長緩慢、縮小甚至完全瘢痕化。有人套用9種蛇毒(眼鏡王蛇、眼鏡蛇、金環蛇、銀環蛇等)的粗毒對多種人實體瘤細胞株，包括子宮頸癌、鼻咽癌、肝癌、胃癌細胞株等進行了直接毒性作用實驗，結果發現眼鏡蛇毒對腫瘤細胞的殺傷作用最強。其中，細胞毒素在體外實驗中，對腫瘤細胞有很強的選擇性、劑量依賴型的殺傷作用。需要注意，不同地區眼鏡蛇毒的細胞毒素抗腫瘤效應不同，是細胞毒素生物學效應和結構不同所致。不同腫瘤對同一細胞毒素的反應也不一致，這與不同腫瘤細胞株的特性有關。
細胞毒素對體內外癌細胞殺傷作用差異大的原因在於CTX進入體內，其作用即被Ca2+所拮抗，作用減弱，加入EDTA後Ca2+被絡合，療效就提高，因此S180載瘤小鼠生命延長率從23%提高到40%，但不可能把體內生理所需的Ca2+都絡合，這提示改良CTX給藥方式，維持CTX長期低濃度發揮作用或利用CTX進行腫瘤的免疫導向治療，從而減輕CTX的不良反應，是取得良好療效的關鍵。
細胞凋亡調控失調是腫瘤發生的主要原因之一，多種抗腫瘤藥物通過誘導細胞凋亡來實現。研究表明，CTXs可引起多種腫瘤細胞凋亡或壞死。在細胞凋亡中線粒體的作用日益受到關注。線粒體是細胞生命活動控制中心，它不僅是細胞呼吸鏈和氧化磷酸化的中心，還是細胞凋亡調控的中心環節之一。線粒體感受多種刺激，發生線粒體滲透性轉變孔（mitochondriapermeabilitytransition pore，MPTP）開放，線粒體形態功能發生改變，釋放膜間隙中的促凋亡蛋白細胞色素c和凋亡誘導因子AIF等參與到caspase信號通路中。釋放到細胞漿的細胞色素c在datp存在的條件下能與凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）結合，使其多聚化而激活，從而召集caspase-9形成凋亡體（apoptosome），caspase-9被激活，繼而激活下游的凋亡效應分子caspase-3，經蛋白水解級聯作用引起細胞凋亡。
在體外，CTXs對多種腫瘤細胞具有直接的細胞毒作用。lwaguchiT等均從印度眼鏡蛇毒中分離出CTX組分，發現其破壞吉田內瘤的能力遠遠大於對正常細胞(人或大鼠紅細胞、脾細胞)的破壞能力;仲曉燕等測定了CTX對子宮頸癌細胞株(HeLa)、鼻咽癌細胞株(CNE)、胃癌細胞株(MGC)和乳鼠心肌細胞毒活性，結果表明對3種人癌細胞株均有明顯的殺傷作用，對正常乳鼠心肌細胞也有破壞作用，但敏感性比人癌細胞低得多。譚獲等研究了蛇毒組分C對8種白血病細胞(K562，J6-1，Mo7e，HPB，U937，Nalm-6，HL60，NB4)的作用，證實上述白血病細胞株對眼鏡蛇毒組分C均較敏感。丁明霞等研究4種細胞毒素(CTX-10，CTX-11，CTX-12和CTX-13)對膀胱癌細胞株(BIU-87和EJ)的抑制作用，發現4種CTX對BIU-87和EJ均有明顯的抑制作用。
體內抗腫瘤作用在體內，CTX能抑制腫瘤生長，使腫瘤體積縮小，宿主壽命延長。Fawzia用黑頸眼鏡蛇蛇毒對接種有艾氏腹水癌細胞的小鼠進行實驗性治療，結果發現能明顯延長小鼠存活時間，降低癌細胞活力。許雲祿等利用舟山眼鏡蛇毒CTX-F，使艾氏腹水瘤荷瘤小鼠的存活時間明顯延長，對小鼠宮頸癌U14及肉瘤S180有明顯的抑瘤作用。GamalA. S等從角蝰蛇中分離得到的不含PLA2活性的細胞毒素組分F4對荷艾氏腹水癌細胞小鼠具有抑制腫瘤細胞生長，延長小鼠存活時間的作用。Chaim等研究了蛇粗毒及細胞毒素P4在體內外對B6-F10黑素瘤和軟骨肉瘤的細胞毒性，結果發現有很強的、不可逆轉的毒性作用，並且對腫瘤細胞有選擇性。
