基因工程
基因工程的概念
基因工程是指按照人們的願望，進行嚴格的設計，通過體外DNA重組和轉基因技術，賦予生物以新的遺傳特性，創造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產品。基因工程是在DNA分子水平上進行設計和施工的，又叫做DNA重組技術。
（一）基因工程的基本工具
1.“分子手術刀”——限制性核酸內切酶（限制酶）
（1）來源：主要是從原核生物中分離純化出來的。
（2）功能：能夠識別雙鏈DNA分子的某種特定的核苷酸序列，並且使每一條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開，因此具有專一性。
（3）結果：經限制酶切割產生的DNA片段末端通常有兩種形式：黏性末端和平末端。
2.“分子縫合針”——DNA連線酶
(1)兩種DNA連線酶（E·coliDNA連線酶和T4-DNA連線酶）的比較：
①相同點：都縫合磷酸二酯鍵。
②區別：E·coliDNA連線酶來源於大腸桿菌，只能將雙鏈DNA片段互補的黏性末端之間的磷酸二酯鍵連線起來；而T4DNA連線酶能縫合兩種末端，但連線平末端的之間的效率較低。
(2)與DNA聚合酶作用的異同：DNA聚合酶只能將單個核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯鍵。DNA連線酶是連線兩個DNA片段的末端，形成磷酸二酯鍵。
3.“分子運輸車”——載體
（1）載體具備的條件：①能在受體細胞中複製並穩定保存。
②具有一至多個限制酶切點，供外源DNA片段插入。
③具有標記基因，供重組DNA的鑑定和選擇。
（2）最常用的載體是：質粒,它是一種裸露的、結構簡單的、獨立於細菌擬核之外，並具有自我複製能力的雙鏈環狀DNA分子。
（3）其它載體：λ 噬菌體的衍生物、動植物病毒
(二)基因工程的基本操作程式
第一步：目的基因的獲取
1.目的基因是指： 編碼蛋白質的結構基因 。
2.原核基因採取直接分離獲得，真核基因是人工合成。人工合成目的基因的常用方法有反轉錄法和化學合成法。
3.PCR技術擴增目的基因
（1）原理：DNA雙鏈複製
（2）過程：第一步：加熱至90～95℃DNA解鏈；第二步：冷卻到55～60℃，引物結合到互補DNA鏈；第三步：加熱至70～75℃，熱穩定DNA聚合酶從引物起始互補鏈的合成。
（3）前提：要有一段已知目的基因的核苷酸序列。
第二步：基因表達載體的構建
1.目的：使目的基因在受體細胞中穩定存在，並且可以遺傳至下一代，使目的基因能夠表達和發揮作用。
2.組成：目的基因+啟動子+終止子+標記基因
（1）啟動子：是一段有特殊結構的DNA片段，位於基因的首端，是RNA聚合酶識別和結合的部位，能驅動基因轉錄出mRNA，最終獲得所需的蛋白質。
（2）終止子：也是一段有特殊結構的DNA片段 ，位於基因的尾端。
（3）標記基因的作用：是為了鑑定受體細胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細胞篩選出來。常用的標記基因是抗生素基因。
第三步：將目的基因導入受體細胞
1.轉化的概念：是目的基因進入受體細胞內，並且在受體細胞內維持穩定和表達的過程。
2.常用的轉化方法：
將目的基因導入植物細胞：採用最多的方法是農桿菌轉化法，其次還有基因槍法和花粉管通道法等。
將目的基因導入動物細胞：最常用的方法是顯微注射技術。此方法的受體細胞多是受精卵。
將目的基因導入微生物細胞：原核生物作為受體細胞的原因是 繁殖快、多為單細胞、遺傳物質相對較少 ，最常用的原核細胞是大腸桿菌 ，其轉化方法是：先用 Ca2+ 處理細胞，使其成為 感受態細胞 ，再將重組表達載體DNA分子 溶於緩衝液中與感受態細胞混合，在一定的溫度下促進感受態細胞吸收DNA分子，完成轉化過程。
3.重組細胞導入受體細胞後，篩選含有基因表達載體受體細胞的依據是標記基因是否表達。
第四步：目的基因的檢測與鑑定
1.首先要檢測 轉基因生物的染色體DNA上是否插入了目的基因，方法是採用 DNA分子雜交技術。
2.其次還要檢測 目的基因是否轉錄出了mRNA，方法是採用 用標記的目的基因作探針與 mRNA雜交。
3.最後檢測 目的基因是否翻譯成蛋白質，方法是從轉基因生物中提取 蛋白質，用相應的 抗體進行抗原－抗體雜交。
4.有時還需進行 個體生物學水平的鑑定。如：轉基因抗蟲植物是否出現抗蟲性狀。
（三）基因工程的套用
1.植物基因工程：抗蟲、抗病、抗逆轉基因植物，利用轉基因改良植物的品質。
2.動物基因工程：提高動物生長速度、改善畜產品品質、用轉基因動物生產藥物。
3.基因治療：把正常的外源基因導入病人體內，使該基因表達產物發揮作用。
（四）蛋白質工程的概念
蛋白質工程是指以蛋白質分子的結構規律及其生物功能的關係作為基礎，通過基因修飾或基因合成，對現有蛋白質進行改造，或製造一種新的蛋白質，以滿足人類的生產和生活的需求。（基因工程在原則上只能生產自然界已存在的蛋白質）
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細胞工程
（一）植物細胞工程
1.理論基礎（原理）：細胞全能性
全能性表達的難易程度：受精卵>幹細胞>體細胞>生殖細胞；植物細胞>動物細胞
2.植物組織培養技術
合併圖冊（2）用途：微型繁殖、作物脫毒、製造人工種子、單倍體育種、細胞產物的工廠化生產。
（3）地位：是培育轉基因植物、植物體細胞雜交培育植物新品種的最後一道工序。
3.植物體細胞雜交技術
生物選修三知識點總結（1）過程：
（2）誘導融合的方法：物理法包括離心、振動、電刺激等。化學法一般是用聚乙二醇（PEG）作為誘導劑。
（3）意義：克服了遠緣雜交不親和的障礙。
（二）動物細胞工程
1. 動物細胞培養
生物選修三知識點總結（1）概念：動物細胞培養就是從動物機體中取出相關的組織，將它分散成單個細胞，然後放在適宜的培養基中，讓這些細胞生長和繁殖。
（2）動物細胞培養的流程：取動物組織塊（動物胚胎或幼齡動物的器官或組織）→剪碎→用胰蛋白酶或膠原蛋白酶處理分散成單個細胞→製成細胞懸液→轉入培養瓶中進行原代培養→貼滿瓶壁的細胞重新用胰蛋白酶或膠原蛋白酶處理分散成單個細胞繼續傳代培養。
（3）細胞貼壁和接觸抑制：懸液中分散的細胞很快就貼附在瓶壁上，稱為細胞貼壁。細胞數目不斷增多，當貼壁細胞分裂生長到表面相互抑制時，細胞就會停止分裂增殖，這種現象稱為細胞的接觸抑制。
（4）動物細胞培養需要滿足以下條件
①無菌、無毒的環境：培養液應進行無菌處理。通常還要在培養液中添加一定量的抗生素，以防培養過程中的污染。此外，應定期更換培養液，防止代謝產物積累對細胞自身造成危害。
②營養：合成培養基成分：糖、胺基酸、促生長因子、無機鹽、微量元素等。通常需加入血清、血漿等天然成分。
③溫度：適宜溫度：哺乳動物多是36.5℃+0.5℃；pH：7.2～7.4。
④氣體環境：95%空氣+5%CO2。O2是細胞代謝所必需的，CO2的主要作用是維持培養液的pH。
（5）動物細胞培養技術的套用：製備病毒疫苗、製備單克隆抗體、檢測有毒物質、培養醫學研究的各種細胞。
2.動物體細胞核移植技術和克隆動物
（1）哺乳動物核移植可以分為胚胎細胞核移植（比較容易）和體細胞核移植（比較難）。
（2）選用去核卵(母)細胞的原因：卵(母)細胞比較大，容易操作；卵(母)細胞細胞質多，營養豐富。
（3）體細胞核移植的大致過程是：（右圖）
核移植
胚胎移植
（4）體細胞核移植技術的套用：
①加速家畜遺傳改良進程，促進良畜群繁育； ②保護瀕危物種，增大存活數量；
③生產珍貴的醫用蛋白； ④作為異種移植的供體；
⑤用於組織器官的移植等。
（5）體細胞核移植技術存在的問題：
克隆動物存在著健康問題、表現出遺傳和生理缺陷等。
3.動物細胞融合
（1）動物細胞融合也稱細胞雜交，是指兩個或多個動物細胞結合形成一個細胞的過程。融合後形成的具有原來兩個或多個細胞遺傳信息的單核細胞，稱為雜交細胞。
（2）動物細胞融合與植物原生質體融合的原理基本相同，誘導動物細胞融合的方法與植物原生質體融合的方法類似，常用的誘導因素有聚乙二醇、滅活的病毒、電刺激等。
（3）動物細胞融合的意義：克服了遠緣雜交的不親和性，成為研究細胞遺傳、細胞免疫、腫瘤和生物新品種培育的重要手段。
（4）動物細胞融合與植物體細胞雜交的比較：
比較項目 細胞融合的原理 細胞融合的方法 誘導手段 用法
植物體細胞雜交 細胞膜的流動性 去除細胞壁後誘導原生質體融合 離心、電刺激、振動，聚乙二醇等試劑誘導 克服了遠緣雜交的不親和性，獲得雜種植株
動物細胞融合 細胞膜的流動性 使細胞分散後誘導細胞融合 除套用植物細胞雜交手段外，再加滅活的病毒誘導 製備單克隆抗體的技術之一
4.單克隆抗體
（1）抗體：一個B淋巴細胞只分泌一種特異性抗體。從血清中分離出的抗體產量低、純度低、特異性差。
（2）單克隆抗體的製備過程
（3）雜交瘤細胞的特點：既能大量繁殖，又能產生專一的抗體。
（4）單克隆抗體的優點：特異性強，靈敏度高，並能大量製備。
（5）單克隆抗體的作用：
① 作為診斷試劑：準確識別各種抗原物質的細微差異，並跟一定抗原發生特異性結合，具有準確、高效、簡易、快速的優點。
② 用於治療疾病和運載藥物：主要用於治療癌症治療，可製成“生物飛彈”，也有少量用於治療其它疾病。
胚胎工程
（一）動物胚胎髮育的基本過程
1、胚胎工程是指對動物早期胚胎或配子所進行的多種顯微操作和處理技術，如胚胎移植、體外受精、胚胎分割、胚胎幹細胞培養等技術。經過處理後獲得的胚胎，還需移植到雌性動物體內生產後代，以滿足人類的各種需求。
2、動物胚胎髮育的基本過程
（1）受精場所是母體的輸卵管上段。
（2）卵裂期：特點：細胞有絲分裂，細胞數量不斷增加，但胚胎的總體體積並不增加，或略有減小。
（3）桑椹胚：特點：胚胎細胞數目達到32個左右時，胚胎形成緻密的細胞團，形似桑椹。是全能細胞。
（4）囊 胚：特點：細胞開始出現分化（該時期細胞的全能性仍比較高）。聚集在胚胎一端個體較大的細胞稱為內細胞團，將來發育成胎兒的各種組織。中間的空腔稱為囊胚腔。
（5）原腸胚：特點：有了三胚層的分化，具有囊胚腔和原腸腔。
（二）胚胎幹細胞
1、哺乳動物的胚胎幹細胞簡稱ES或EK細胞，來源於早期胚胎或從原始性腺中分離出來。
2、具有胚胎細胞的特性，在形態上表現為體積小，細胞核大，核仁明顯；在功能上，具有發育的全能性，可分化為成年動物體內任何一種組織細胞。另外，在體外培養的條件下，可以增殖而不發生分化，可進行冷凍保存，也可進行遺傳改造。
3、胚胎幹細胞的主要用途是：
①可用於研究哺乳動物個體發生和發育規律；
②是在體外條件下研究細胞分化的理想材料，在培養液中加入分化誘導因子，如牛黃酸等化學物質時，就可以誘導ES細胞向不同類型的組織細胞分化，這為揭示細胞分化和細胞凋亡的機理提供了有效的手段；
③可以用於治療人類的某些頑疾，如帕金森綜合症、少年糖尿病等；
④利用可以被誘導分化形成新的組織細胞的特性，移植ES細胞可使壞死或退化的部位得以修復並恢復正常功能；
⑤隨著組織工程技術的發展，通過ES細胞體外誘導分化，定向培育出人造組織器官，用於器官移植，解決供體器官不足和器官移植後免疫排斥的問題。
（三）胚胎工程的套用
1.體外受精和胚胎的早期培養
(1)卵母細胞的採集和培養：
主要方法：用促性腺激素處理，使其排出更多的卵子，然後，從輸卵管中沖取卵子，直接與獲能的精子在體外受精。第二種方法：從剛屠宰母畜的卵巢中採集卵母細胞；第三種方法是藉助超音波探測儀、腹腔鏡等直接從活體動物的卵巢中吸取卵母細胞。採集的卵母細胞，都要在體外經人工培養成熟後，才能與獲能的精子受精。
(2) 精子的採集和獲能：在體外受精前，要對精子進行獲能處理。
(3) 受精：獲能的精子和培養成熟的卵細胞在獲能溶液或專用的受精溶液中完成受精過程。
(4)胚胎的早期培養：精子與卵子在體外受精後，應將受精卵移入發育培養液中繼續培養，以檢查受精狀況和受精卵的發育能力。培養液成分較複雜，除一些無機鹽和有機鹽外，還需添加維生素、激素、胺基酸、核苷酸等營養成分，以及血清等物質。當胚胎髮育到適宜的階段時，可將其取出向受體移植或冷凍保存。不同動物胚胎移植的時間不同。(牛、羊一般要培育到桑椹胚或囊胚階段才能進行移植，小鼠、家兔等實驗動物可在更早的階段移植，人的體外受精胚胎可在8~16個細胞階段移植。)
2.胚胎移植
(1)胚胎移植是指將雌性動物的早期胚胎，或者通過體外受精及其它方式得到的胚胎，移植到同種的、生理狀態相同的其它雌性動物的體內，使之繼續發育為新個體的技術。其中提供胚胎的個體稱為“供體”，接受胚胎的個體稱為“受體”。（供體為優良品種，作為受體的雌性動物應為常見或存量大的品種。）
地位：如轉基因、核移植，或體外受精等任何一項胚胎工程技術所生產的胚胎，都必須經過胚胎移植技術才能獲得後代，是胚胎工程的最後一道“工序”。
(2) 胚胎移植的意義：大大縮短了供體本身的繁殖周期，充分發揮雌性優良個體的繁殖能力。
(3) 生理學基礎：①動物發情排卵後，同種動物的供、受體生殖器官的生理變化是相同的。這就為供體的胚胎移入受體提供了相同的生理環境。
②早期胚胎在一定時間內處於游離狀態。這就為胚胎的收集提供了可能。
③受體對移入子宮的外來胚胎不發生免疫排斥反應。這為胚胎在受體的存活提供了可能。
④供體胚胎可與受體子宮建立正常的生理和組織聯繫，但供體胚胎的遺傳特性在孕育過程中不受影響。
(4) 基本程式主要包括：
①對供、受體的選擇和處理。選擇遺傳特性和生產性能優秀的供體，有健康的體質和正常繁殖能力的受體，供體和受體是同一物種。並用激素進行同期發情處理，用促性腺激素對供體母牛做超數排卵處理。
②配種或人工授精。
③對胚胎的收集、檢查、培養或保存。配種或輸精後第7天，用特製的沖卵裝置，把供體母牛子宮內的胚胎沖洗出來(也叫沖卵)。對胚胎進行質量檢查，此時的胚胎應發育到桑椹或胚囊胚階段。直接向受體移植或放入－196℃的液氮中保存。
④對胚胎進行移植。
⑤移植後的檢查。對受體母牛進行是否妊娠的檢查。
3.胚胎分割
(1)概念：是指採用機械方法將早期胚胎切割2等份、4等份等，經移植獲得同卵雙胎或多胎的技術。
(2)意義：來自同一胚胎的後代具有相同的遺傳物質，屬於無性繁殖。
(3)材料：發育良好，形態正常的桑椹胚或囊胚。（桑椹胚至囊胚的發育過程中，細胞開始分化，但其全能性仍很高，也可用於胚胎分割。）
(4)操作過程：對囊胚階段的胚胎分割時，要將內細胞團均等分割，否則會影響分割後胚胎的恢復和進一步發育。
安全倫理問題
（一）轉基因生物的安全性爭論 ：
(1)基因生物與食物安全：
反方觀點：反對“實質性等同”、出現滯後效應、出現新的過敏原、營養成分改變
正方觀點：有安全性評價、科學家負責的態度、無實例無證據
(2)轉基因生物與生物安全：對生物多樣性的影響
反方觀點：擴散到種植區之外變成野生種類、成為入侵外來物種、重組出有害的病原體、成為超級雜草、有可能造成“基因污染”
正方觀點：生命力有限、存在生殖隔離、花粉傳播距離有限、花粉存活時間有限
(3)轉基因生物與環境安全：對生態系統穩定性的影響
反方觀點：打破物種界限、二次污染、重組出有害的病原微生物、毒蛋白等可能通過食物鏈進入人體
正方觀點：不改變生物原有的分類地位、減少農藥使用、保護農田土壤環境
（二）生物技術的倫理問題
(1)複製人：兩種不同觀點，多數人持否定態度。
否定的理由：複製人嚴重違反了人類倫理道德，是克隆技術的濫用；複製人衝擊了現有的婚姻、家庭和兩性關係等傳統的倫理道德觀念；複製人是在人為的製造在心理上和社會地位上都不健全的人。
肯定的理由：技術性問題可以通過胚胎分級、基因診斷和染色體檢查等方法解決。不成熟的技術也只有通過實踐才能使之成熟。
中國政府的態度：禁止生殖性克隆，不反對治療性克隆。四不原則：不贊成、不允許、不支持、不接受任何生殖性複製人的實驗。
(2)試管嬰兒：兩種目的試管嬰兒的區別兩種。不同觀點，多數人持認可態度。
否定的理由：把試管嬰兒當作人體零配件工廠，是對生命的不尊重；早期生命也有活下去的權利，拋棄或殺死多餘胚胎，無異於“謀殺”。
肯定的理由：解決了不育問題，提供骨髓中造血幹細胞救治患者最好、最快捷的方法，提供骨髓造血幹細胞並不會對試管嬰兒造成損傷。
(3)基因身份證：
否定的理由：個人基因資訊的泄漏造成基因歧視，勢必造成遺傳學失業大軍、造成個人婚姻困難、人際關係疏遠等嚴重後果。
肯定的理由：通過基因檢測可以及早採取預防措施，適時進行治療，達到挽救患者生命的目的。
（三）生物武器
(1)種類：致病菌、病毒、生化毒劑，以及經過基因重組的致病菌。
(2)散布方式：吸入、誤食、接觸帶菌物品、被帶菌昆蟲叮咬等。
(3)特點：致病力強、多數具傳染性、傳染途徑多、污染面廣、有潛伏期、不易被發現、危害時間長等。
(4)禁止生物武器公約及中國政府的態度。
