一般檢查
1.外觀檢查 軟包裝蘑菇罐頭,外觀膨脹、呈氣囊狀。為濱州市某食品加工廠生產,批號為20011206。
2.內容物檢查 無菌操作,用無菌剪子將膨脹罐頭打開,有大量氣體溢出,再用滅菌鑷子取內容物約20g,移入無菌容器內,待細菌檢驗。變質罐頭蘑菇塊較正常罐頭色澤暗,酷酸臭味,湯汁混濁,pH為4.5。正常蘑菇罐頭37℃保溫10d,打開,色澤正常,無異味,湯汁較清,pH為6.8。
3. 塗片染色鏡檢 取變質罐頭內容物湯汁部分,直接塗片,固定後革蘭染色,鏡檢見革蘭陽性梭狀芽孢桿菌,再取正常罐頭湯汁部分塗片、固定後革蘭染色,鏡檢未見細菌繁殖。
細菌分離與鑑定
商業無菌檢驗 取變質罐頭內容物與正常罐頭37℃保溫10d後內容物,分別接種庖內培養基,37℃觀察5d,庖內培養基55℃厭氧觀察3d,溴甲酚紫葡萄糖內湯(帶倒管),37℃觀察5d,溴甲酚紫葡萄糖肉湯(帶倒管)55℃觀察3d。結果除變質罐頭內容物在庖內培養基內55℃厭氧培養3d產酸產氣外,其餘接種管均未見細菌生長。陽性管塗片染色見革蘭陽性梭狀芽孢桿菌,菌體大小為0.5μm×3~5μm,芽孢位於菌體末端並且膨大。觀查動力,運動不活潑。
熱解糖梭菌的檢驗
1.增菌 取變質罐頭內容物2g分別熱接種PE-2培養基和改良PE-2培養基(綠豆代替豌豆),加蠟,速冷,置55℃厭氧培養72h,結果培養管內液體均混濁,變黃色且產氣。兩種培養基內變化無差別。
2.分離取增菌液分別接種PE-2瓊脂培養基與改良PE-2瓊脂培養基,55℃厭氧培養48h,菌落均為灰白色,偏平,邊緣不整齊,表面有光澤,中心稍凸,直徑1~2mm,塗片染色為革蘭陽性端生芽胞梭菌。兩種培養基上菌落特性相同。
3.生化反應取分離菌種分別接種到0.5%糖類培養基及其它生化培養基,55℃厭氧培養72h。結果顯示,該菌能分解葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露糖、蔗糖、半乳糖、果糖、木膠糖、阿拉伯糖、棉子糖、纖維二糖、水楊苷、澱粉產酸並產氣,不能分解蛋白質、甘露醇、山梨醇、衛矛醇、肌醇、甘油、尿素,卵磷脂酶、硫化氫、硝酸鹽還原、明膠液化呈陰性反應,在2%NaCI、4%NaCI中不能生長,在10%葡萄糖中能生長,但不能在15%葡萄糖中生長。
4.在不同pH環境中生長情況 取分離菌種分別接種不同pH的PE-2培養液與改良PE-2培養液,55℃厭氧培養72h,結果其生長範圍為pH4.0~8.5,最佳生長pH為6.0~7.0。與文獻報導相同。
5.在不同溫度條件下生長情況 取分離菌種分別接種PE-2培養液和改良PE-2培養液,放不同溫度下厭氧培養觀察7d,結果37℃以下不生長,37~45℃微弱生長,55~60℃生長最好。
6.在不同培養基內的生長情況 將菌種分別接種於幾種不同的培養基。55℃厭氧培養72h,結果在含水量0.1%硫乙醇酸鈉的卵黃瓊酯、改良PE-2瓊脂、亞硫酸鈉葡萄糖瓊脂、庖肉培養基、PYG培養液中生長良好, 但在亞硫酸鈉瓊脂內不生長。
7.動物實驗選體重為1.5kg健康兔子2隻,取該菌72h培養液(55℃厭氧)給予灌胃,每隻20ml,觀察7d,未見不良反應。將培養液離心,取上清液進行小白鼠(18~20g)腹腔注射,每隻0.5ml,共4隻,觀察7d未見異常反應。
討論
1.實驗表明,從酸敗變質的軟包裝蘑菇罐頭中分離出1株嗜熱厭氧性芽孢梭菌,經對其形態、培養特性、生理生化、毒理等特性的實驗,結果與Bregey手冊(第8版)關於熱解糖酸菌的描述相符。證明了由該菌引起上述軟包裝蘑菇罐頭髮生產氣性變質。
實驗中,對PE-2培養基進行了改進,用綠豆代替PE-2培養基中的豌豆,其它成分不變,結果生長良好,檢出菌在2種培養基上生長無差別。
2.產氣性變質通常是指罐聽發生膨脹的變質而言,這種變質系由專性嗜熱的產芽孢厭氧菌—嗜熱解糖梭菌所引起。實驗顯示,該菌是專性厭氧菌,最適生長溫度為55℃。其分解糖的能力很強,能分解葡萄糖、乳糖、蔗糖、水楊苷及澱粉等多種糖類而產酸和大量氣體,不分解蛋白質、不能使硝酸鹽還原、不產生毒素,也不能引起感染。但是它具有酸敗性,如芽孢先在較高溫度(50~55℃)下發芽,則37℃14d就可產生酸敗,使內容物常常帶有酪酸臭味或乾酪樣臭味。其最適pH是6.0~7.0,有時能在pH為4.1到4.5的番茄產品中發生酸敗,而低於pH4.0以下的罐頭食品的酸敗與嗜熱厭氧菌是無關的。
3.商業無菌檢驗是1990年衛生部批准實施的罐頭食品檢驗方法。目前,國際上許多國家都採用此法,我國現已將其列為國家標準,但時間較短,還存在一些問題有待推廣與提高。在商業無菌罐頭中可能存在耐高溫的無毒的嗜熱芽孢桿菌,如熱解糖梭菌,按國標方法中商業無菌檢驗要求,只有預定要輸往熱帶地區(40℃以上)的低酸性罐頭食品才進行55℃保溫試驗,而37℃保溫試驗不容易檢出該菌,因而,若罐頭中殘留該菌尚未引起膨脹變質時,常檢驗為合格,但因罐頭加工過程中冷熱不及時,使殘留芽孢在較高溫度(50~55℃)下發芽,即使在非熱帶地區(40℃以下)仍然會慢慢引起罐頭酸敗變質。此外,存放罐頭食品如與熱源靠得太近,使部分罐頭食品受熱,也可造成發生食品酸敗。因此,建議輸往非熱帶地區的罐頭食品也應進行55℃保溫試驗。以杜絕由熱解糖酸菌引起的罐頭變質。
4.熱解糖梭菌廣泛分布於外界環境中,可通過水體、土壤,農副產品等污染罐頭食品,已經發現輔料如糖、奶粉、澱粉、穀類以及營養糊是嗜熱厭氧菌的主要來源。國外報導在生原料如蘑菇和洋蔥的產品中曾發現該菌。在罐頭加工過程中,若殺菌不徹底,再加上加工後不能立即冷卻,產品溫度較長時間保持在45~65℃之間,殘留的芽孢即可發芽、生長繁殖。尤其罐頭中多含有澱粉等含糖輔料,造成罐頭食品發生酸敗變質。所以,在罐頭加工過程中應嚴格進行殺菌,殺菌後切忌堆放,應立即通風冷卻,將罐頭中心溫度立即有效地冷卻到43℃以下, 並將罐頭遠離熱源在低於35℃的地方儲存,這樣嗜熱厭氧菌的存在就不重要了,從而保證達到商業無菌,減少罐頭食品變質,避免經濟損失。