測定根系活力(TTC法)
原理氯化三苯基四氮唑(TTC)是標準氧化還原電位為80mV的氧化還原物質,溶於水中成為無色溶液,但還原後即生成紅色而不溶於水的三苯基甲 (ttf),如圖。 生成的TTF比較穩定,不會被空氣中的氧自動氧化,所以TTC被廣泛地用作酶試驗的氫受體,植物根所引起的TTC還原,可因加入琥珀酸、延胡索酸、蘋果酸得到增強,而被丙二酸、碘乙酸所抑制。所以TTC還原量能表示脫氫酶活性,並作為根系活力的指標。
儀器與用具?? 分光光度計;分析天平(感量0.1mg);恆溫箱1台;研缽1套;100ml三角瓶;漏斗;移液管10ml 1支、2ml 1支、0.5ml 1支;20ml刻度試管;10ml容量瓶;小培養皿;試管架,藥匙;石英砂適量。試劑乙酸乙酯;
連二亞硫酸鈉(Na2S2O4,為強還原劑,俗稱保險粉);
1%TTC溶液:準確稱取TTC 1.0g,溶於少量蒸餾水中,定容至100ml;
0.4%TTC溶液:準確稱取TTC 0.4g,溶於少量蒸餾水中,定容至100ml;
磷酸緩衝液(1/15mol/L,pH7.0);
1mol/L硫酸:用量筒量取比重1.84的濃硫酸55ml,邊攪拌邊加入盛有500ml蒸餾水的燒杯中,冷卻後稀釋至1000ml;
0.4mol/L琥珀酸鈉:稱取琥珀酸鈉(含6個結晶水)10.81g,溶於蒸餾水中,定容至100ml。
1.定性測定
(1)配置反應液 把1%TTC溶液,0.4moL/L琥珀酸鈉和磷酸緩衝液按1:5:4比例混合。
(2)把根仔細洗淨,把地上部分從莖基切除,將根放入三角瓶中,倒入反應液,以浸沒根為度,置37℃左右暗處放1h,以觀察著色情況,新根尖端幾毫米以及細側根都明顯地變成紅色,表明該處有脫氫酶存在。
2.定量測定
(1)TTC標準曲線的製作
吸取0.25ml 0.4%TTC溶液放入10ml容量瓶,加少許Na2S2O4粉末,搖勻後立即產生紅色的TTF。再用乙酸乙酯定容至刻度,搖勻。然後分別取此液0.25ml、0.5ml、1.00ml、1.50ml、2.00ml置10ml容量瓶中,用乙酸乙酯定容至刻度,即得到含TTF25μg、50μg、100μg、150μg、200μg的標準比色系列,以空白作參比,在485nm波長下測定光密度,繪製標準曲線。
(2)稱取根樣品0.5g,放入小培養皿(空白試驗先加硫酸再加入根樣品,其他操作相同),加入0.4%TTC溶液和磷酸緩衝液的等量混合液10ml,把根充分浸沒在溶液內,在37℃下暗處保溫1h,此後加入1mol/L硫酸2ml,以停止反應。
(3)把根取出,吸乾水分後與乙酸乙酯3~4ml和少量石英砂一起磨碎,以提出TTF。把紅色提出液移入試管,用少量乙酸乙酯把殘渣洗滌二至三次,皆移入試管,最後加乙酸乙酯使總量為10ml,用分光光度計在485nm下比色,以空白作參比讀出光密度,查標準曲線,求出四氮唑還原量。
(4)計算
將所得數據帶入下式,求出四氮唑還強度。
種子生活力快速測定?
原理??有生活力的種子能夠進行呼吸代謝,在呼吸代謝途徑中由脫氫酶催化所脫下來?的氫酶催化所脫下來的氫可以將無色的2,3,5-三苯基氯化四唑還原為紅色、不溶性的甲月替,而且種子的生活力越強,代謝活動越旺盛,被染成紅色的程度越深,死亡的種子由於沒有呼吸作用,因而不會將TTC還原為紅色。種胚生活力衰退或者部分喪失生活力,則染色較淺或局部被染色。因此,可以根據種胚染色的部位以及染色的深淺程度來判定種子的生活力。
試劑0.5%TTC溶液;TTC溶液最好隨用隨配,不宜久藏。溶液應遮光貯藏。若已經變為紅色,則不能繼續使用。
方法?1.浸種
將種子用溫水(30~?35℃?)浸泡2~6h,使種子充分吸脹。
2.顯色
隨機取吸脹種子20粒,小心剝去種皮,務必不要傷害種胚。然後將處理好的種子置於小白瓷碗中,加入0.5%TTC溶液,以剛好浸沒水中煮5min後,再加入0.5%TTC溶液染色。
3.統計
染色結束後要立即進行鑑定,因放置太久會褪色。倒出TTC溶液,再用清水將種子沖洗1~2次,觀察種胚被染色的情況。凡種胚全部或大部分被染成紅色的即為具有生活力的種子,種胚不被染色的為死種子。根據上述標準鑑定煮沸和未煮沸種子的生活力。
花粉活力的測定
原理根據有活力的花粉粒在呼吸過程中產生氧化還原反應,無活力的花粉粒無此反應。當TTC滲入有活力的花粉粒內,並作為氫受體被脫輔酶上的氫還原時,便由無色的氯化三苯四氮唑(TTC)變為紅色的三苯基甲唑(TTF)(適用作新鮮花粉經乾燥等加工處理後的活力指標,對陳舊不新鮮的花粉,這一指標的變化另當別論)。
試劑0.5%TTC溶液(稱取TTC 0.5克放入燒杯中加入少許95%酒精使用溶解,然後用蒸餾水稀釋至100毫升。溶液避光保存,溶液發紅時,不能再用)
方法1.取少許花粉置於載玻片上,加1~2滴TTC溶液,蓋上蓋玻片。
2.將製片放入30℃恆溫箱中放置15分鐘。然後在顯微鏡下觀察。凡被染為紅色的活力強;淡紅色的次之;無色者沒有活力的花粉。
3.觀察2~3個製片,每片取5個視野,統計100粒,然生計算花粉的活力百分率。