單細胞全轉錄組測序技術是在單細胞水平對全轉錄組進行擴增與測序的一項新技術。其原理是將分離的單個細胞的微量全轉錄組RNA進行擴增後進行高通量測序。
對單個細胞轉錄組的分析由Brady等[1]和Eberwine等[2]分別利用基於PCR技術的對單個細胞cDNA的指數擴增和基於T7RNA連線酶體外轉錄(invitrotranscription)的線性擴增進行了初步的探索。2006年，Kurimoto等[3]改進了單細胞cDNA擴增方法，將定向的PCR擴增與線性擴增相結合，對單個ESC進行了單細胞cDNAmicroarray分析，在高覆蓋率和準確性的前提下，使基因表達的代表性和再現性都有了明顯的提高。而隨著測序技術的發展，Tang等[4]將單細胞cDNA擴增技術和新一代測序技術相結合而首次創立的單細胞RNA測序分析套用於單個小鼠的卵裂球，最終發現了晶片未檢測到的5200多個基因和1800個可變剪下點。相比而言，單細胞cDNAmicroarray分析技術成熟，成本低廉，尤其適用於分析已知基因上調或下調的一般轉錄信息，但是該系統相對比較封閉，對於未知基因的檢測無能為力，並且不能提供mRNA的確切長度和序列;而單細胞RNA測序則是一個開放的系統，能夠提供更加詳細和準確的轉錄信息，尤其可對未知基因的轉錄進行檢測，但是該方法價格昂貴，並且對於結果的分析需要強大的計算機系統提供保障。哈佛大學謝曉亮院士推出基於MALBAC技術的單細胞轉錄組擴增技術[5,6]，可以對單個細胞、單條染色體或者0.5皮克的RNA進行高保真擴增，並且已經進行了商業化運作。最近發展的單分子測序技術無需逆轉錄酶和擴增步驟，但測序錯誤率高。我們相信隨著技術發展這些局限性會逐步最佳化和改進。
圖1：MALBAC技術原理 MALBACPrimershavinga27-ntcommonsequencefollowedbyeightrandomnucleotidesareannealedtothegenomicDNAtemplate.Strand-displacementsynthesisgeneratespartialamplicons,whicharesubsequentlydenaturedfromthetemplateat94°C.PrimingtonewpositionsonthegenomicDNAtemplategeneratesmorepartialamplicons,whichincreasescoverageofthegenomewitharesultingreductioninamplificationbias.PrimingnadextensiononthepartialampliconsyieldcompleteampliconshavingtheMALBACprimersequenceat5’endanditscomplementarysequenceatthe3’end.Denaturationat94°Cregeneratestheoriginaltemplateandanowlargerandmorediversepoolofpartialamplicoms.Fullampliconsformloops,whichmayberesistanttosubsequentamplificationandhybirdization.Fullampliconsaregeneratedforeightcyclesandtheexponentiallyamplifiedbyabout14-21cyclesusingprimerscomplementarytothecommonregionoftheMALBACprimers.
參考文獻
[1]BradyG,BarbaraM,IscoveNN.RepresentativeinvitrocDNAamplificationfromindividualhemopoietic cellsandcolonies.MethodsMolCellBiol1990;2:17-25.
[2]EberwineJ,YehH,MiyashiroK,CaoY,NairS,FinnellR,etal.Analysisofgeneexpressioninsingle liveneurons.ProcNatlAcadSciUSA1992;89(7):3010-4.
[3]KurimotoK,YabutaY,OhinataY,OnoY,UnoKD,YamadaRG,etal.Animprovedsingle-cellcDNAamplificationmethodforefficienthigh-densityoligonucleotidemicroarrayanalysis.NucleicAcidsRes2006;34(5):e42.
[4]TangF,BarbacioruC,NordmanE,LiB,XuN,BashkirovVI,etal.RNA-Seqanalysistocapturethe transcriptomelandscapeofasinglecell.NatProtoc2010;5(3):516-35.
[5]ZongCZ,LuSJ,ChapmanAR,XieXS.Genome-WideDetectionofSingleNucleotideandCopyNumberVariations ofaSingleHumanCell.Science2012;338(6114):1622-6.
[6]LuSJ,ZongCZ,XieXS,etal.ProbingMeioticRecombinationandAneuploidyofSingleSpermCellsbyWholeGenomeSequencingusingMALBAC.Science2012;338(6114):1627-30.
