單向定量免疫電泳

單向定量免疫電泳又稱火箭電泳（rocket immunoelectrophoresis）。在瓊脂內摻入適量的抗體，在電場作用下，定量的抗原泳動遇到瓊脂內的抗體，形成抗原—抗體複合物沉澱下來。走在後面的抗原繼續在電場作用下向正極泳動，遇到瓊脂內沉澱的抗原—抗體複合物，抗原量的增加造成抗原過量，使複合物沉澱溶解，一同向正極移動而進入新的瓊脂內與未結合的抗體結合，又形成新的抗原—抗體複合物沉澱下來，不斷地沉澱—溶解—再沉澱，直至全部抗原和抗體結合，在瓊脂內形成錐形的沉澱峰，稱火箭電泳。火箭峰的長度與標準抗原比較，可計算待測抗原的濃度。本實驗以人血清作為抗原，免疫動物（家兔）產生抗血清，當適量抗原、抗體在瓊脂糖中擴散，兩者相遇時，則形成抗原抗體複合物的白色沉澱線。不同的抗原分子與相應的抗體分子的擴散速度不同，當兩者間比例適當時，出現數目不同的沉澱線，根據沉澱線的出現可以定性抗原、診斷疾病或測定抗體的效價。

試劑和器材

一、試劑

單向定量免疫電泳

抗原：胎甲球蛋白（1—5mg/mL）。

免疫血清（抗血清）：家兔抗人胎甲球蛋白血清。

瓊脂糖（或進口分裝瓊脂粉）。

pH 8.6電極緩衝液（巴比妥緩衝液）離子強度0.05m：取巴比妥1.84g, 巴比妥鈉10.3g溶於蒸餾水，定溶至1L。製備瓊脂溶液時需要將上述緩衝稀釋一倍，離子強度為0.025m。

二、器材

載玻片、打孔器、微量取液器、稀釋板、培養器或帶蓋培養皿。

操作方法

一、抗體瓊脂板的製備

將融化的瓊脂冷卻到55℃，加入適量（看免疫血清的效價高低而定）的抗體，立即混勻（不要出現泡沫），將上述的抗體瓊脂（大約20ml）製成瓊脂板，冷卻後按圖打孔備用。

二、加樣在各孔里加入不同稀釋度的抗原。

三、電泳

在平板電泳槽里倒進離子強度m=0.05的巴比妥緩衝液。將凝膠板平放在電泳槽中的隔板上。瓊脂的兩端用浸溫的濾紙做橋與電泳槽的電極緩衝液相連線，抗體端接正極。通電，電流強度按瓊脂板的寬度計算（1-2mA/cm）。觀察到白色沉澱線時，即電泳完畢（一般1小時左右）。一般通電後調電壓為10V/cm ，或電流強度為2~4mA/cm時間約1~5小時。

四、定量抗原

在電泳一定時間後可以觀察到火箭狀的白色沉澱峰。電泳完畢後可以用肉眼觀察量出已知抗原量的各個火箭的高度，畫出標準曲線，便可測出未知濃度的抗原量。如果精確計算的話，可用求積儀測定峰的面積。

注意事項

（1）影響單向定量免電泳的因素很多，主要是要選擇好抗體濃度，使抗原抗體濃度比例合適。這就需要根據免疫血清的效價來定所加入瓊脂中的抗體量，如效價高，則免疫血清瓊脂的比例為1：5-9，如效價低，則免疫血清與瓊脂的比例為2：5。

（2）加入的抗體量要合適，以保證抗原、抗體的合適比例，以便形成清晰的沉澱峰。抗體的準確用量應通過預實驗來決定，即：加入不同量的抗血清，用一定量的抗原進行火箭電泳，選出沉澱峰在2-5cm之間的相應抗體濃度就是合適的抗體用量。