周祥駿自幼聰穎，7歲入鄉辦塾室就讀，從小即是書癖，天資絕高。13歲入蕭縣榆莊張幼卿家塾讀書，喜讀兵書、喜論兵，志以武略報國。16歲入縣學，補為秀才。20歲時因品學兼優，升為廩膳生員。期間有大量詩作問世。編注了《四書教科》，出版了《瑣語》等書。22歲於家設館授徒。早期南社成員郭愛棠、我國佛教研究者劉仁航是祥駿先生的學生。
清光緒二十一年(1895年)清政府與日本簽訂《馬關條約》，周祥駿義憤至極開始改研哲學，推尋救國之法。聯合眾徒隨處演講，撰寫時曲小調，如《十杯酒》、《嘆五更》等，課餘選鄉中青少年排演。在地方上影響很大。
1901年《辛丑條約》簽訂，各帝國列強瓜分中國，周祥駿將滿腔憂憤傾注筆端，連續創作雜劇《睡獅園》、《康秀才投軍》、《打醋缸》、《捉酸蟲》、《胭脂曲》、《團匪魁》、《黑龍江》、《薛慮祭江》等政治觀點鮮明、抨擊清政腐敗、列強入侵的雜劇。1907年在徐州發起組織“天足會”撰寫洋洋百句的七言長詩《天足會演說感賦》倡導男女平權、婦女解放、主張興女學。宣統元年(1909)周祥駿在縣昭義書院講學，積極從事反清的革命組織和宣傳活動。同年秋在上海憲政講習所，遇高鈍劍、柳亞子、陳巢南、姚鳳石、胡樸安等名士，與之縱談經史哲學，意氣相投，結為南社。11月南社成立，祥駿先生撰《奉酬高鈍劍》一詩，並致書高鈍劍，對創辦南社的宗旨提出看法：“認為南社應辦成講學機關，不能同一般泛泛文會。”翌年返鄉受聘於睢寧潼北師範傳習所任教務主任。是年秋，南京學務會所設議紳六人，由省屬各府推舉，周祥駿當選為徐(州)屬各縣代表，再度南下。1911年2月赴上海參加南社第四次雅集，對南社的選文方向提出看法，1911年10月前，致書高鈍劍，希望亞子、巢南、鈍劍諸南社領袖發布“獨立之文”，其政治遠見卓識可見。辛亥革命爆發，周祥駿冒險從南京到鎮江，參與第九鎮軍軍務。12月林、柏攻克南京。後被第一鎮軍統制柏文蔚聘為第一鎮軍軍事顧問官，屢建功勞。南京攻克後清政府江南提督張勛逃至徐州，祥駿先生秘密潛回徐州，以徐州省立第七師範教員身份從事革命工作，為驅張迎柏作準備。1912年3月袁世凱竊取了辛亥革命果實，祥駿先生極為憤慨，寫下了《傷心文》，矛頭直指袁世凱，痛陳禍國。此後其部分詩文、瑣語、講義，集冊為《更生齋類稿》，分甲乙兩編，由上海和江蘇兩大書局陸續發行。不久又以《風山類稿》書名在彭城付印。1914年4月20日被張勛以“亂黨”罪逮捕，入銅山地方監獄；京、蘇掀起浩大的營救祥駿先生浪潮，徐州各界人士集會、請願；紳士、巨賈派代表到衙門求情；南社柳亞子、胡樸安、程先甲均設法營救；時任陸軍部次長徐樹錚發急電營救均未果。5月16日晨被殺害於徐州西門(武安門)外，赴死時周祥駿吟絕命詩“輸將豪氣風生谷，照澈澄懷月印潭”從容就義。時年45歲。
1928年9月12日，由柳亞子、于右任、胡樸安等數十人呈請，中華民國政府發布第495號訓令，撥款千元撫恤其遺屬，並指令在周祥駿就義之地，建立周祥駿烈士紀念碑。1929年國民黨元老於右任和南社領導人柳亞子、邵立子等42人，為追懷義烈發出兩次徵文啟事，徵得詩文、輓聯千餘篇，于右任親自寫輓聯“橫經針孔孟，瀝血鑄淮徐。”這應當是對周祥駿一生很中肯的評價。
周祥駿生平撰述百萬言，多散佚。1944年由柳亞子、郭愛棠親自鑑定的《更生齋全集》出版，（現武漢辛亥革命博物館珍藏一套）此書是周祥駿在獄中親自校勘後，由周祥駿的長子周公權從獄卒手中花錢購回；1962年由安徽大學張須教授和周祥駿少子周揚季編選了《更生齋選集》，由於文革此書只進行到校對階段而被迫停止。選集中收錄了史學家顧頡剛先生為周祥駿撰寫的碑文，以及周祥駿遺稿中發現的全集未曾編入的劇本《先烈周仲穆先生手著戲曲》、《菊部新腔》、《風山新曲》合計八篇。選集中收入六篇。
周祥駿夫人朱氏，育有三子一女，長子周公權、媳魏電岩；二子周道銘為營救先生不幸早卒；女周道芬遵先生遺囑嫁給先生的學生張仁序，後不幸病故；三子周揚季（道鑾）抗戰期間組織鄉里青壯年抗擊日本侵略者，以後加入共產黨參加革命，解放後在蚌埠任職。先生就義二年後由柳亞子介紹舉家四口加入南社，周公權入社號：794；魏電岩入社號：924；周道芬入社號：925；周揚季入社號：926。
中華人民共和國成立後，1956年，徐州市人民政府在雲龍山召開了“愛國主義者周祥駿先生紀念大會”。會上周祥駿烈士遺屬周揚季(道鑾)，將烈士遺藏圖書和文史資料全部捐獻給徐州市圖書館，後被運至南京博物館。2005年5月睢寧縣人民政府在馬淺村為周祥駿烈士樹碑建墓，並列為愛國主義教育基地。2007年睢寧縣英烈牆建立，排名第一位的就是周祥駿烈士。
