原理
iTRAQ 技術採用4種或8種同位素編碼的標籤，通過特異性標記多肽的氨基基團，而後進行串聯質譜分析，可同時比較4種或8種不同樣品中蛋白質的相對含量或絕對含量。
iTRAQ試劑是一種小分子同重元素化學物質，包括三部分：一端是報告部分reporter group，另一端是肽反應部分peptide reactive group，中間部分是平衡部分balance group。
iTRAQ試劑示意圖以4標為例，其中：
1）reporter group：質量為114Da、115 Da、116 Da、117 Da。
2）peptide reactive group：將reporter group與肽N端及賴氨酸側鏈連線，幾乎可以標記樣本中所有蛋白質。
3）balance group：質量為31 Da、30 Da、29 Da、28 Da，使得四種iTRAQ試劑分子量均為145 Da，即等量異位標籤（isobaric tag），保證iTRAQ標記的同一肽段m/z相同。
同位素標記相對和絕對定量將蛋白質裂解為肽段，然後用iTRAQ試劑進行差異標記。由於iTRAQ試劑是等量的，即不同同位素在標記同一多肽後在第一級質譜檢測，分子量完全相同，用串聯質譜方法對在第一級質譜檢測到前體離子（precursor ion）進行碰撞誘導解離，產物離子通過第二級質譜進行分析。在二級質譜分析過程中，報告基團、質量平衡基團和多肽反應基團之間的鍵斷裂，質量平衡基團丟失，產生低質荷比（m/z）的報告離子。由於二級質譜可分析相對分子質量相差1的報告基團，不同報告基團離子強度的差異就代表了它所標記的多肽的相對豐度。同時，多肽內的醯胺鍵斷裂，形成一系列b離子和y離子，得到離子片段的質量數，通過資料庫查詢和比較，可以鑑定出相應的蛋白質前體。
技術特點
•定量精確：每組平行比較多達8個樣本，標記效率高達97%，可減少樣本處理、以及不同組上機造成的實驗誤差。
•高效率樣品分離：進行SCX-HPLC分離，實現自動化操作。
•高鑑定率：系統全面地研究組織或細胞中儘可能多的蛋白質，可鑑定多達6000種蛋白。
•適用範圍廣：無物種特異性限制，理論上可用於所有物種。iTRAQ技術不僅可發現胞漿蛋白，還有膜蛋白、核蛋白、胞外蛋白。
•儀器性能優良：基於高解析度（大於105）、高質量精度（小於1ppm）質譜平台，可獲得更加準確的結果。iTRAQ技術可檢測出低豐度蛋白、強鹼性蛋白、小於10KD或大於200KD的蛋白。
實驗流程
1.不同的蛋白質樣品 S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7 和 S8，首先分別進行蛋白酶水解（通常為胰蛋白酶Trypsin）；
2. 採用不同的標記對酶解片段進行標記後混合；
3. 使用液體色譜和質譜的聯用進行一級質譜；
4. 8 個不同來源的，同一蛋白的同一個標記肽段在一級質譜上表現為一個 峰；
5. 對加入標記的肽段進行二級質譜，同時，平衡基團從報告基團上脫落；
6. 二級質譜後，報告基團在二級質譜低質量區域產生8個報告離子信號：113、114、115、116、117、118、119 和 121，其強度分別代表 8 個標記的樣品的同一個肽段；
7. 報告離子的峰面積比值就是同一蛋白質同一肽段在不同樣品間的比值；
8. 對質譜儀所得的數據進行生物信息分析，定性和定量研究。
樣品要求
1. 蛋白運輸：24小時內可以4℃運輸；
2. 蛋白長期保存：-20℃；
3. 待檢測蛋白要求：蛋白量最低50ug，濃度最低要 為5ug/ul 10ul，否則同位素無法標記；
4. 蛋白提取試劑要求：使用普通的組織、細胞裂解液即可，不要使用二維電泳試劑提取。
檢測儀器
同位素標記相對和絕對定量TripleTOF 5600系統是第一個把廣泛定性探索，快速全貌解析，和高解析度定量結合在一個單一精確質量平台的系統。新一代的TripleTOFTM5600+系統增加了創新的數據採集方法，合規性的軟體，兼容離子淌度差分質譜技術，能夠完成以前不可能的研究。 在日採集中，它結合了最高的檢測靈敏度，高解析度和至少5倍最佳採集速度，以及穩定的質量準確度。TripleTOF 5600+系統是快速評估藥物代謝穩定性、藥物在體內特徵和最終代謝產物鑑定的理想平台。在最快採集速度條件下，用高分辨和準確質量質譜數據，完成無與倫比的蛋白質定性鑑定工作。
套用
•非常高的通量，同時標記8個樣品，一次實驗實現多達8個樣品的蛋白質鑑定和定量；
•標記完全，標記效率高達97%以上可減少樣本處理、以及不同組上機造成的實驗誤差；
•可以進行多個時間點蛋白質組動態變化的監測；
•可以分析詳細分期/型的臨床疾病樣本，並可設計樣本重複，甚至可以進行個體樣本的研究；
•可以研究細胞周期、細胞信號傳導整個過程的蛋白質組動態學；
•適用範圍廣：無物種特異性限制，理論上可用於所有物種。
